Detekce antimikrobiální rezistence u původců sexuálně přenosných infekcí

Pavlína KREJČÍKOVÁ

Bachelor's thesis

Detection of antimicrobial resistance in sexually transmitted infections

Abstract:

Sexuálně přenosné infekce (STD) představují riziko pro veřejné zdraví, a to zejména z hlediska nárůstu antibiotické rezistence. V předkládané práci jsou shrnuty poznatky o nejčastějších původcích těchto infekcí, laboratorní diagnostice a současné epidemiologii, antimikrobiální rezistenci a jejích molekulárních mechanismech. Stanovení antimikrobiální citlivosti u většiny původců STD není v rutinní mikrobiologii možné z hlediska vysokých nebo specializovaných kultivačních nároků. Také, v současné době, z důvodu vyšší citlivosti detekce, jsou k diagnostice STD využívány metody molekulární biologie, které upozaďují provádění kultivace u Neisserie gonorrhoeae. Experimentální část projektu si kladla za cíl detekci popsaných mechanismů rezistence v pozitivních vzorcích na přítomnost původců STD vyšetřených pomocí mutiplexové PCR. V prvním kroku bylo použito celogenomové sekvenování (WGS). Bohužel, získané sekvence obsahovaly velké množství humánních sekvencí a extrahumánní sekvence tak neposkytovaly dostatečné pokrytí pro detekci jednotlivých genů a mutací. Nedostatečné pokrytí bylo zjištěno i po odstranění části humánní DNA ze vzorku pomocí saponinu a tritonu-X. Vzhledem k nevhodnosti WGS jsme optimalizovali a zavedli dříve popsané metody cílově specifické molekulární detekce nejčastějších mechanismů rezistence u N. gonorrhoeae. První metodou je PCR amplifikace s analýzou křivek tání (HRM). Jako referenční metodu k HRM jsme použili Sangerovo sekvenování šesti genů (penA, mtrR, ponA, porB, 23S rRNA, gyrA). V průběhu řešení práce byly optimalizovány teplotní profily pro PCR amplifikaci jednotlivých genů. Pro úplné pokrytí sekvenovaného úseku DNA (genu) dále bylo nutné navrhnout doplňující sekvenační primery. Pro klinické použití HRM pro detekci mechanismů rezistence u N. gonorrhoeae je nutné metodu ověřit na vzorcích DNA s identifikovanými mechanismy rezistence pomocí sekvenování jednotlivých fragmentů, které bylo v předložené práci optimalizováno.

Abstract:

Sexually transmitted diseases (STDs) pose a public health risk, especially in terms of the rise of antibiotic resistance. This thesis summarizes the knowledge on these infections, most common causative agents, laboratory diagnosis and current epidemiology, antimicrobial resistance and its molecular mechanisms. Determination of antimicrobial susceptibility in most STD pathogens is not possible in routine microbiology due to high or specialized culture requirements. Also, because of the higher sensitivity of detection, molecular biology methods are used to diagnose STDs, which negates the need to perform culture in Neisseria gonorrhoeae. The experimental part of the project aimed to detect the described resistance mechanisms in positive samples tested by multiplex PCR for the presence of STD agents. In the first part, we used whole genome sequencing (WGS). Unfortunately, the sequences obtained contained a large number of human sequences and thus the extra-human sequences did not provide sufficient coverage. The same result was achieved after a sample pretreatment with saponin and Triton-X followed by purification. Due to the unsuitability of WGS, we attempted to optimize and implement previously described target-specific methods to detect the most common resistance mechanisms in Neisseria gonorrhoeae. The first method was PCR amplification with melting curve analysis (HRM). As a reference method to HRM, we used Sanger sequencing of six genes (penA, mtrR, ponA, porB, 23S rRNA, gyrA). During this work, we optimized the temperature profiles for PCR amplification of individual genes. To cover the analyzed DNA fragment (part of the gene) it was necessary to design additional sequencing primers. The clinical use of HRM for the detection of resistance mechanisms in N. gonorrhoeae needs to be validated on DNA samples with identified resistance mechanisms by specific fragment sequencing, which was optimized in the present work.

Keywords

Antibiotika, bakterie, rezistence, sexuálně přenosné infekce, PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2023

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Marcela Krůtová, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Sciences

Bachelor programme / field:
Laboratory Diagnostics / Laboratory Diagnostics