Struktura a funkce plazmidů klinicky významných kmenů Staphylococcus aureus

Mgr. Lucie Kuntová, Ph.D.

Disertační práce

Structure and function of plasmids from clinical important Staphylococcus aureus strains

Anotace:

Mobilní genetické elementy (MGE) tvoří zásadní složku variabilní části bakteriálního genomu. U druhu Staphylococcus aureus se podílí na multirezistenci a virulenci kmenů a poskytují tak evoluční výhodu, která spolu s dalšími faktory vede k vytvoření vysoce klonálního charakteru populace S. aureus. Z hlediska přenosu genů rezistence k antimikrobiálním látkám jsou nejvýznamnějšími zástupci MGE plazmidy. Tato práce přináší ucelenou informaci o obsahu a charakteru plazmidů v populaci S. aureus v České republice. Reprezentativní soubor 73 kmenů byl získán z 15-ti českých nemocnic v letech 2000-2008. Kombinací mikrobiologických a molekulárně biologických metod bylo zjištěno, že v analyzovaném souboru kmenů bylo 24 různých typů plazmidů o velikostech v rozmezí od 1,3 do 55 kb. 89 % kmenů obsahovalo jeden nebo více plazmidů. Dále bylo stanoveno, že obsah konkrétních typů plazmidů ve většině případů koreluje s příslušností kmene k určité klonální skupině (clonal cluster, CC), případně se plazmidy vyskytují u příbuzných klonů dle zásad variability restrikčně modifikačních (RM) systémů tak, jak je popsal Corvaglia a kol. (2010). Byla stanovena kompletní sekvence tří plazmidů pDLK1-3. Srovnávací analýza sekvencí plazmidů pDLK1 a pDLK2 v databázi GenBank ukázala, že tyto plazmidy existují v populaci S. aureus v téměř nezměněné podobě již desítky let, což svědčí o jejich strukturní a evoluční stabilitě. pDLK3 je mozaikovitý kryptický plazmid, který nese geny pro několik replikačních proteinů a také analog oriT místa, které je zásadní pro iniciaci přenosu plazmidů. Dále byly v souboru zjištěny velké (>20 kb) penicilinázové plazmidy a plazmid nesoucí gen pro enterotoxin D, malé plazmidy kódující rezistenci k erytromycinu, tetracyklinu nebo chloramfenikolu a řada kryptických plazmidů. V souboru kmenů epidemického klonu USA300 bylo experimentálně prokázáno, že jedním z hlavních vektorů přenosu plazmidů jsou transdukující fágy, a to jak laboratorní, tak fágy přirozeně se vyskytující v kmenech. Metodou qPCR byla prokázána vysoká frekvence sbalování plazmidů do fágových částic 10-5 CFU/PFU. Rovněž bylo prokázáno, že geny rezistence nesené na plazmidech se transdukcí nejen přenesou do nové hostitelské buňky, ale je zachována i jejich exprese. Celkově práce přináší podrobnou informaci o výskytu, charakteru a přenosu plazmidů v české populaci S. aureus. Výsledky přispěly k bližšímu pochopení klonální struktury a evolučních vztahů mezi kmeny a mohou se stát podkladem pro vypracování systému kontroly šíření viruentních faktorů a genů rezistence k antimikrobiálním látkám, které významně zvyšují patogenitu těchto kmenů.

Abstract:

Mobile genetic elements (MGEs) represent a substantial part of variable part of bacterial genome. MGEs contribute to multiresistance and virulence of Staphylococcus aureus strains and together with other factors lead to highly clonal character of S. aureus population. As far as antimicrobial resistance genes transfer is concerned the most important MGE type are plasmids. This study provides comprehensive information about plasmid content of S. aureus population in Czech Republic. For this purpose, we collected 73 strains from 15 Czech hospitals in 2000-2008. By combination of microbiological and molecular biological methods it was found, that there were 24 different plasmid types in range from 1.3 to 55 kb in the analyzed set of strains, and that 89 % of S. aureus isolates contained one or more plasmid types. We also found, that occurrence of particular plasmid types was in most cases in correlation with certain clonal clusters (CC) or that individual plasmid types were harboured by strains classified to cognate CC based on the variability in their restriction modification (RM) systems as described by Corvaglia a kol. (2010). We determined sequences of three plasmids pDLK1-3. A comparative sequence analysis showed, that plasmids pDLK1 and pDLK2 occurred in S. aureus population in nearly unchanged form for dozen of years, which give an evidence about their structure and evolutionary stability. pDLK3 was cryptic plasmid with highly mosaic structure, that carried genes coding for several replication proteins as well as a site for plasmid transfer initiation oriT. We also found many large (>20 kb) penicillinase plasmids and enterotoxin D positive plasmid, small plasmids coding for erythromycin, tetracycline or chloramphenicol resistance, and cryptic plasmids in analysed strain collection. In the set of strains classified to epidemic clone USA300 we experimentally proved, that both laboratory and naturally occurring transducing bacteriophages represent one of the main plasmid transfer vectors. By qPCR method, the high frequency (10-5 CFU/PFU) of packaging of plasmids into phage particles was established. We also demonstrated, that expression of plasmid bore genes transduced to new host cell is preserved. Altogether our study provides detailed description of occurrence, types and transfer of plasmids in Czech population of S. aureus. Our results contribute to further understanding of clonal structure and evolution of S. aureus strains and on the basis of our data it could be developed a new control system for preventing the spread of staphylococcal virulence and resistance factors.

Klíčová slova

Staphylococcus aureus, horizontální přenos genů, plazmidy, mobilní genetické elementy, klonální skupina, bakteriofágy

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 4. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 5. 2013
• Vedoucí: prof. RNDr. Jiří Doškař, CSc.
• Oponent: doc. MVDr. Renata Karpíšková, Ph.D., prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie