Optimalizace redukce a alkylace proteinů před polyakrylamidovou elektroforézou pro následnou MS identifikaci po in-gel štěpení

Jakub Lhotský

Bachelor's thesis

Optimalization of protein reduction and alkylation prior polyacrylamide electrophoresis for subsequent identification after in-gel digestion

Abstract:

Polyakrylamidová gelová elektroforéza je v současnosti nejpoužívanější metodou, sloužící k separaci proteinů z komplexních biologických směsí. Ve spojení s hmotnostní spektrometrií představuje mocný nástroj, sloužící k analýze a identifikaci proteinů. Přestože metody jednorozměrné a dvourozměrné polyakrylamidové elektroforézy doznaly během posledních desetiletí značného pokroku, v současnosti nejsou překonány všechny obtíže, které s sebou tyto metody přinášejí. Kritickým krokem je příprava proteinového vzorku. MS analýza proteinů probíhá většinou na peptidech, vzniklých enzymatickým nebo chemickým štěpením proteinů. Pro zisk kvalitního fondu peptidů je nutné rozrušit terciární a kvarterní strukturu proteinů redukcí disulfidových vazeb a zabránit jejich reoxidaci procesem alkylace. Tím je dosaženo zvýšení efektivity štěpení proteinů na peptidy. Cílem mé práce byla optimalizace podmínek redukce a alkylace proteinů s využitím různých redukčních a alkylačních činidel před gelovou elektroforézou a provést srovnání proti klasické metodě redukce a alkylace v gelu po elektroforéze. Lepších výsledků bylo dosaženo s použitím 0,25 mM tris(2-karboxyethyl)fosfinu a 22,73 mM iodoacetamidu při pH 8 před

Abstract:

Nowadays, polyacrylamide gel electrophoresis is now the most widely used method for the separation of proteins from complex biological mixtures. In conjunction with mass spectrometry it presents powerful tool for the analysis and identification of proteins. Although the methods of one-dimensional and two-dimensional electrophoresis have improved significantly over past few decades, there are still some complications that are not overcome yet. The critical step is sample preparation. MS identification of proteins is usualy based on peptides generated by enzymatic or chemical cleavage of proteins. To get a quality fund of peptides, the tertiary and quarternary structure of proteins must be disrupt by reduction of disulfide bonds and released thiol group must be prevented of reoxidation by the process of alkylation. By this approach the effectivity of cleavage of proteins to peptides is highly increased. The aim of my work was to optimize conditions of reduction and alkylation of proteins using different reducing and alkylating reagents before electrophoresis and compared to the classical metod in which the reduction and alkylation is done by dithiothreitol and iodoacetamide in in gel after electrophoresis; the best resuls were achieved by reduction with tris(2-carboxyethyl)phosphine and alkylation with iodoacetamide in buffer pH 8 before electrophoresis

Keywords

Proteomika, SDS-PAGE, BSA, redukce, alkylace, štěpení v gelu, hmotnostní spektrometrie

Keywords

Proteomics, SDS-PAGE, BSA, reduction, alkylation, in-gel digestion, mass spectrometry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 8. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 2. 9. 2010
• Supervisor: René Lenobel
• Reader: Tomáš Pospíšil

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Bachelor programme / field:
Chemie / Aplikovaná chemie