Ribozomální stres a aktivace p53

Barbora HAROKOVÁ

Master's thesis

Ribosomal stress and activation of p53

Abstract:

Předkládaná diplomová práce se zabývá ribozomálním stresem a aktivací p53. Pozornost je zaměřena zejména na protein DDX56, který je pravděpodobně zapojen do procesu sestavování 60S ribozomální podjednotky. Byla zkoumána souvislost proteinu DDX56 s ribozomálním stresem a aktivací p53, která nebyla do této doby detailně objasněna. Teoretická část obsahuje literární rešerši na téma ribozomální biogeneze, ribozomální stres a aktivace p53, dále je zde rozebrána problematika degradace ribozomálních proteinů a v neposlední řadě také RNA helikázy s důrazem na DEAD-box helikázy DDX56 a DDX51. V experimentální části bylo studováno chování proteinu DDX56 po navození ribozomálního stresu pomocí actinomycinu D o různých koncentracích (1 nM, 5 nM a 10 nM) a různé délce časového ovlivnění (3, 6 a 24 hodin) u buněčné linie U2OS a dále u linií HeLa, BJ a MRC-5. Byl testován účinek bortezomibu a UV záření na hladinu DDX56. Pomocí inhibitorů proteasomu, bortezomibu a MLN7243, byl zjišťován mechanismus destabilizace DDX56. Byly použity metody western blotting, imunofluorescenční analýza a siRNA transfekce. Výsledky vedou k závěru, že je protein DDX56 degradován po navození ribozomálního stresu pomocí actinomycinu D, a to pravděpodobně v proteasomu. Pomocí transfekce siDDX56 došlo k down-regulaci proteinu DDX56 a ke zvýšení hladiny p53. Předpokládáme, že nedostatek proteinu DDX56 může způsobit ribozomální stres a aktivaci proteinu p53, která je závislá na RPL11.

Abstract:

This diploma thesis deals with ribosomal stress and activation of p53. Attention is especially directed to DDX56 protein, which is probably involved in the assembly of the 60S ribosomal subunit. The relationship of DDX56 protein with ribosomal stress and p53 activation, which has not yet been elucidated in detail, has been investigated. The theoretical part includes a literature review on the topic of ribosomal biogenesis, ribosomal stress and p53 activation, degradation of ribosomal proteins and RNA helicases emphasizing the DEAD-box helicases DDX56 and DDX51. In the experimental part, behavior of DDX56 protein after induction of ribosomal stress with actinomycin D at various concentrations (1 nM, 5 nM and 10 nM) and different duration of time (3, 6 and 24 hours) in the U2OS cell line and HeLa, BJ and MRC-5 lines was studied. The effect of bortezomib and UV radiation on the DDX56 level was tested. Using proteasome inhibitors, bortezomib and MLN7243, the DDX56 destabilization mechanism was investigated. Western blotting, immunofluorescence analysis and siRNA transfection were used. The results lead to the conclusion that DDX56 protein is degraded following the induction of ribosomal stress by actinomycin D, presumably via the proteasome pathway. After siDDX56 transfection DDX56 protein was silenced and p53 level was increased. We assume that lack of DDX56 protein can cause ribosomal stress and activation of p53 protein, which is dependent on RPL11.

Keywords

Ribozomální stres, p53, DDX56, actinomycin D, U2OS

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Pavel Moudrý, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology