Izolace a konstrukce biokatalyzátorů pro enviromentální aplikace

Mgr. Táňa Koudeláková, Ph.D.

Disertační práce

Isolation and construction of biocatalysts for environmental applications

Anotace:

Dlouhodobě udržitelný rozvoj je jedním z hlavních témat tohoto století, a proto narůstá zájem o biokatalyzátory využitelné při ekologických výrobních postupech a technologiích zpracování odpadů. Tato práce se věnuje halogenalkandehalogenasam, enzymům s dehalogenační aktivitou, atraktivním pro využití v průmyslu a při ochraně životního prostředí. Příslušníci této dobře prostudované rodiny jsou zajímaví též jako modelové enzymy rozsáhlé super-rodiny alfa/beta-hydrolas. Cílem této práce bylo získat nové halogenalkandehalogenasy izolací nebo metodami proteinového inženýrství a studovat na nich mechanismy ovlivňující jejich selektivitu, substrátovou specificitu a stabilitu. Porozumění těmto mechanismům může vést ke konstrukci robustních, účinných a selektivních enzymů s širokým aplikačním potenciálem pro různé biotechnologické procesy. V Kapitole 1 je popsán objev enantioselektivity halogenalkandehalogenas, který vedl k rozpoznání jejich užitečnosti pro výrobu opticky čistých alkoholů a halogenovaných látek. Enatioselektivita není obecnou vlastností všech halogenalkandehalogenas, neboť záleží jak na enzymu tak i substrátu. Halogenalkandehalogenasa DbjA z Bradyrhizobium japonicum USDA110 vykazuje enantioselektivitu vůči různým alfa-bromesterům a beta-bromalkanům za použití dvou různých způsobů kinetické enantiodiskriminace. Konstrukce mutantních variant prokázala, že molekulární interakce, odlišné pro alfa-bromestery a beta-bromalkany, mohou být odděleně modifikovány inženýrstvím povrchové smyčky. Jelikož je enantioselektivita modulována i pouhou jednobodovou mutací, nepředvídatelná selektivita a specifita může být objevena u nově izolovaných halogenalkandehalogenas. Kapitola 2 popisuje identifikaci, klonování a charakterizaci DrbA z Rhodopirellula baltica SH1 a DmbC z Mycobacterium bovis 5033/66, prvních zástupců nové podrodiny halogenalkandehalogenas. Tyto enzymy s novou katalytickou pentádou byly objeveny na základě nízké homologie proteinové sekvence s již známými halogenalkandehalogenasami. Tyto oligomerní enzymy vykazují pouze nízkou dehalogenační aktivitu. Jejich charakterizace však prokázala, že geny alogenalkandehalogenas mohou být nalezeny v rozličných bakteriálních kmenech, a poskytla data pro následnou analýzu substrátové specificity (v Kapitole 3). Specificita devíti přírodních a čtyř uměle připravených halogenalkan-dehalogenas je na základě jejich funkčních vztahů kvantitativně porovnaná statistickou analýzou v Kapitole 3. Tohoto srovnání vedlo k rozdělení enzymů do čtyř skupin. Shoda mezi evolučními a funkčními vztahy enzymů nebyla pozorována, jelikož i evolučně blízce příbuzné halogenalkandehalogenasy vykazovaly rozdílné substrátové preference. Strukturní a funkční porovnání přírodních a připravených enzymů ukázalo, že sekvenci odpovídající architektura aktivního místa a hlavního tunelu není jediným faktorem určujícím jejich substrátovou specificitu. V Kapitole 4 je zachycena analýza dalších faktorů důležitých pro substrátovou specificitu a selektivitu halogenalkandehalogenas. Aktivní místo enantioselektivní DbjA bylo transplantováno do proteinového prostředí halogenalkandehalogenasy DhaA z Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064. Přestože si geometrie aktivních míst nově připraveného enzymu a DbjA odpovídaly s atomární přesností, kinetické vlastnosti obou enzymů se lišily. Měření časově závislé fluorescence a molekulárně-dynamické simulace ukázaly rozdíly v dynamice a hydrataci u vstupu do kapsy aktivního místa určené původním proteinovým okolím. Inženýrství dynamiky a hydratace proteinů je budoucí výzvou pro racionální design proteinů. Dalším náročným úkolem racionálního proteinového inženýrství je příprava s

Anotace:

tabilních biokatalyzátorů, neboť stabilita enzymů je klíčová pro jejich průmyslové využití. V Kapitole 5 jsme studovali stabilitu DhaA vůči zvýšené teplotě a přítomnosti organického rozpouštědla. Strukturní, kinetická a počítačová charakterizace řady mutantů, připravených náhodnou a místně řízenou mutagenezí ukázala, že pro významné zlepšení stability postačuje jen několik substitucí tunelových aminokyselin. Modelování přístupových cest je efektivním způsobem pro stabilizaci enzymů se zanořeným aktivním místem. Tato práce ukazuje, že halogenalkandehalogenasy jsou enzymy s rozmanitými vlastnostmi a aplikačním potenciálem. Jejich specificita, enantiosektivita a stabilita můžou být dále modifikovány inženýrstvím tvaru, dynamiky a/nebo hydratace jejich aktivních míst a přístupových cest. Inženýrství přístupových tunelů, popsané v této práci, by mělo být obecně využitelné pro inženýrství enzymů se zanořeným aktivním místem.

Abstract:

Sustainable development is one of the main issues of this century, thus the demand for biocatalysts useful in clean production technologies and waste treatment has been intensively growing. This Thesis is focused on haloalkane dehalogenases, the dehalogenating enzymes attractive for industrial and environmental applications. Members of this well-characterized family are interesting also as model enzymes for the large alpha/beta-hydrolase fold superfamily. The aim of this Thesis was to acquire novel haloalkane dehalogenases by isolation and protein engineering methods in order to study the mechanisms determining their selectivity, substrate specificity and stability. The better understanding of these determinants can facilitate construction of robust, efficient and selective enzymes with wide application potential for various biotechnology processes. The discovery of enantioselectivity of haloalkane dehalogenases described in Chapter 1 led to recognition of their utility for production of optically pure alcohols and halogenated compounds. Enatioselectivity, however, is not a general property of all haloalkane dehalogenases and is both enzyme- and substrate-dependent. Haloalkane dehalogenase DbjA from Bradyrhizobium japonicum USDA110 exhibits enantioselectivity towards several alpha-bromoesters and beta-bromoalkanes with two distinct bases of kinetic enantiodiscrimination. Constructed mutants proved that different molecular interactions with alpha-bromoesters and beta-bromoalkanes can be modified separately by engineering of the surface loop. As a single-point mutation can modulate enantioselectivity, the unpredictable selectivity and specificity can be achieved by newly isolated haloalkane dehalogenases. Chapter 2 describes identification, cloning and characterization of DrbA from Rhodopirellula baltica SH1 and DmbC from Mycobacterium bovis 5033/66, the first representatives of the novel haloalkane dehalogenase subfamily. These enzymes possessing the novel catalytic pentad were identified based on low protein sequence homology with known haloalkane dehalogenases. These oligomeric enzymes exhibit only low dehalogenating activity. Nevertheless, their characterization proved that haloalkane dehalogenase genes can be found in various bacterial strains and provided data for subsequent analysis of substrate specificity (in Chapter 3). Chapter 3 quantitatively compares specificity of nine wild-type and four constructed haloalkane dehalogenases according to their functional relationships by statistical analysis. Based on this comparison, the haloalkane dehalogenases were classified into four substrate specificity groups. No correspondence between evolutionary and functional relationships was observed because even close evolutionary relatives exhibited different substrate preference. Structural and functional comparison of wild-type and engineered enzymes revealed that the sequence-related architecture of the active site and the main access tunnel are not the only determinants of the substrate specificity. The study of additional determinants important for the substrate specificity and selectivity of haloalkane dehalogenases is described in Chapter 4. The active site of enantioselective DbjA was transplanted to the scaffold of haloalkane dehalogenase DhaA from Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13064. Although the geometry of the active-site of the newly constructed enzyme corresponded to the active site of DbjA with atomic accuracy, its kinetic properties were distinct. The subsequent time-dependent fluorescence measurements and molecular dynamics simulations revealed the scaffold-determined differences in dynamics and hydration at the entry to the active-site pocket. The engineering of dynamics and hydration represents a challenge for the rational protein design. Another challenging task for rational protein design is construction of stable biocatalysts. The enzyme stability is crucial for their industrial applications. Stability of DhaA t

Abstract:

o elevated temperature and presence of organic co-solvent was examined in Chapter 5. The structural, kinetic and computational characterization of a set of mutants prepared by random and site-directed mutagenesis showed that only a few substitutions of the tunnel residues are sufficient for significant improvement of the stability. Redesign of access tunnels is an efficient approach for stabilization of enzymes with buried active sites. In summary, this Thesis shows that haloalkane dehalogenases are enzymes with miscellaneous properties and a wide application potential. Their specificity, enantioselectivity and stability can be further modified by engineering of shape, dynamics and/or hydration of active sites and access tunnels. Engineering of access tunnels, demonstrated in this Thesis, should be generally applicable for engineering of enzymes with buried active sites.

Keywords

enviromentální aplikace, proteinové inženýrství, izolace, substrátová specifita, enantioselektivita, stabilita, halogenalkandehalogenasa, environmental applications, protein engineering, isolation, substrate specificity, enantioselectivity, stability, haloalkane dehalogenase

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 9. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 9. 2011
• Vedoucí: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Oponent: RNDr. Lubomír Janda, Ph.D., prof. RNDr. Břetislav Brzobohaý, CSc., Ing. Ludmila Martínková, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie (čtyřleté) / Chemie životního prostředí