Využití pluripotentních kmenových buněk při regeneraci cévního endotelu

Mgr. Barbara Šalingová, Ph.D.

Doctoral thesis

The utilisation of pluripotent stem cells in regeneration of vein endothelium

Abstract:

ABSTRAKT Ischemická choroba srdeční (CAD) je hlavní příčinou úmrtí ve vyspělých zemích po celém světě. Dostupná léčba ukazuje 30% incidenci recidivy onemocnění. Bylo prokázáno, že endoteliální kmenové buňky (EPCs) významně přispívají k samotné endoteliální opravě a k regulaci reakce na zranění. lidské indukované pluripotentní kmenové buňky (hiPSCs) díky svým jedinečným vlastnostem, neomezenému potenciálu proliferace a schopnosti diferenciace na jakýkoli druh tkáně, poskytují neomezený buněčný zdroj pro derivaci hiPSC-EC. Funkčnost a reprodukovatelnost diferenciačního procesu však zůstává nedostatečné pochopena, stejně jako funkce a charakteristiky endoteliálních buněk odvozených z hiPSC (hiPSC-ECs). Superparamagnetické nanočástice oxidu železitého (SPIONs) byly navrženy jako mechanismus pro vizualizaci a manipulaci buněk in vivo. Nabízejí perspektivní nástroj pro buněčné navádění v terapii po umístění stentu. Jsou schopny projít buněčnou membránou a učinit buňku reaktívní na magnetické pole. Magneticky značené buňky mohou být naváděny do místa poranění a vizualizovány pomocí MRI. Tento mechanismus poskytuje zcela revoluční prostředek buněčného navádění a vizualizace in vivo pro klinickou terapii. V budoucích studiích je nanejvýš důležité charakterizovat absorpci uSPION, exocytózu, cytotoxicitu a magnetické funkce buněk po značení. Cílem této práce bylo optimalizovat postup diferenciace endotelu a podrobně charakterizovat výslednou buněčnou populaci. Optimalizovali jsme robustní protokol pro diferenciaci hiPSC-ECs. Diferencovali jsme 9 linek hiPSC a nezjistili jsme žádný významný rozdíl v účinnosti diferenciace. Odvozené hiPSC-ECs jsme porovnávali s maturovanými EC. Ukázali jsme odlišnou regulaci povrchového receptoru KDR v hiPSC-ECs ve srovnání s maturovanými EC, což by mohlo naznačovat vývojově mladší fenotyp ve srovnání s maturovanými EC. Tato práce se dále zaměřila na optimalizaci magnetické značení hiPSC-ECs neobalenými SPIONs (uSPIONs). Ukázali jsme různí absorbci uSPIONs mezi různými typy buněk, což je s největší pravděpodobností výsledkem rozdílu ve vlastnostích membrány. Navíc jsme prokázali různou absorpci uSPIONs mezi maturovanými EC a hiPSC-ECs s identickým DNA profilem. Příčina tohoto rozdílu nebyla nalezena a vyžaduje další zkoumání, protože různé membránové vlastnosti hiPSC-ECs mohou mít významný účinek v buněčné terapii. Také jsme demonstrovali magnetické vlastnosti značených buněk. Nezjistili jsme žádné akutní nebo dlouhodobé cytotoxické účinky uSPIONs ani žádný účinek léčby na fenotyp buněk a angiogenní vlastnosti. Ukázali jsme bezpečný a efektivní způsob diferenciace a magnetického značení hiPSC-ECs.

Abstract:

ABSTRACT Coronary Artery Disease (CAD) is the leading cause of death in developed countries worldwide. The available treatment shows 30% of incidence of disease recurrence. Endothelial Progenitor Cells (EPCs) were shown to be major contributors to endothelial repair itself and to regulation of the injury response. Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) due to their unique qualities, unlimited proliferation potential and ability to differentiate into any kind of tissue, provide an unlimited cell source for the derivation of hiPSC-ECs. However, the fidelity, functionality and reproducibility of the differentiation process, along with the function and characteristics of hiPSC-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs) remains poorly understood. Superparamagnetic Iron-Oxide Nanoparticles (SPIONs) were proposed as a mechanism for visualization and the manipulation cells in vivo. They offer a perspective tool for cell guidance in therapy after bare stent placement. They are able to pass through the cell membrane and render the cell responsive to a magnetic field. Magnetically labelled cells can be guided to the injury site and visualized by MRI. This mechanism provides an unprecedented means of cell guidance and visualization in vivo for clinical therapy. For further studies it is of the utmost importance to characterize SPION uptake, exocytosis, cytotoxicity and magnetic functions of cells after labelling. The aim of this work was to optimize the endothelial differentiation procedure and closely characterize the resulting cell population. We optimized a robust protocol for differentiation of hiPSC-ECs. We differentiated 9 hiPSCs lines and did not find any significant difference in differentiation efficiency. We compared the derived hiPSC-ECs with mature ECs. We showed the different regulation of the KDR surface receptor in hiPSC-ECs compared to mature ECs, which could indicate developmentally earlier phenotype in comparison with mature ECs. Furthermore, this thesis aimed to optimize magnetic cell labeling of the derived hiPSC-ECs with uncoated SPIONs (uSPIONs). We showed different uSPION uptake between different cell types, which is most likely the result of different membrane properties. Moreover, we showed different uSPION uptake between mature ECs and hiPSC-ECs with the same DNA profile. The cause of this difference was not found and warrants further investigation because different membrane properties of hiPSC-ECs can have a significant effect in cell therapy. We also demonstrated the magnetic properties of the labelled cells. We did not show any acute or long-term cytotoxic effects of uSPIONs or any effect of the treatment on cell phenotype and angiogenic properties. We demonstrated a safe and efficient way of hiPSC-ECs’ derivation and magnetic labelling.

Keywords

human pluripotent stem cells, endothelial progenitor cells, differentiation, reprogramming, uncoated superparamagnetic nanoparticles, magnetic guidance lidské pluripotentní kmenové buňky, endoteliální progenitorové buňky, diferenciace, reprogramace, neobalené superparamagnetické nanočastice magnetické navádení

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 2. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 29. 5. 2020
• Supervisor: doc. RNDr. Irena Koutná, Ph.D.
• Reader: Mgr. Jana Krejčí, Ph.D., Mgr. Elena Filová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics