Analysis of posttranslational modifications of proteins using mass spectrometry

Mgr. Vojtěch FRANC

Doctoral thesis

Abstract:

V úvodu této disertační práce je popsána pozice hmotnostní spektrometrie (MS) v biologii a význam proteomiky v analýze posttranslačních modifikací (PTM) proteinů. Dále pojednává o posttranslačních modifikacích proteinů, obzvláště pak o N- a O-glykosylacích. Popsána je důležitost N- a O-glykanů a některé strategie jejich MS analýzy. Experimentální část je rozdělana na tři části: 1) Přehled metod, 2) Analýza N-glykosylace v rostlinných proteinech, a 3) Analýza O-glykosylace v pantové oblasti (HR) polymerního myelomového imunoglobulinu alpha 1 (pIgA1). První část popisuje strategii analytického pracovního postupu a zabývá se hlavními použitými metodami (obzvláště mikrogradientovým zařízením). Druhá část se zabývá rostlinnými glykoproteiny cytokinin oxidasou/dehydrogenasou (CKO; EC 1.5.99.12) a měď-obsahujícími aminoxidasami (CAO; EC 1.4.3.22, dříve EC 1.4.3.6). Za účelem analýzy N-glykanů a deglykosylovaných N-glykopeptidů obsahujících residuální N-acetylglukosamin, který byl vázán na původně obsazených N-glykosylačních místech, byla provedena enzymová deglykosylace CKO a CAO endoglykosidasou H za denaturujících podmínek kombinovaná s proteolytickým štěpením trypsinem. Uvolněné N-glykany byly podrobeny manuální chromatografické purifikaci následované MALDI-TOF/TOF MS a MS/MS analýzou. Tryptické N-glykopeptidy (v případě CAO byly použity i jiné proteasy) byly analyzovány přímo MALDI-TOF MS nebo separovány použitím kapalinové chromatografie s obrácenou fází (RPLC) a následně analyzovány MALDI-TOF/TOF MS a MS/MS. RPLC separace použitím jednoduchého mikrogradientového zařízení poskytla zjednodušení glykopeptidové směsi a vyústila ve zlepšenou analýzu glykosylačních modifikací. Rekombinantní kukuřičný CKO isoenzym 1 (ZmCKO1) exprimovaný v Yarrowia lipolytica obsahoval 9 potenciálních N-glykosylačních míst. Glykopeptidová sekvenční analýza potvrdila N-glykosylaci na Asn52, 63, 134, 294, 323 a 338. Zajímavé je, že Asn338 jako jediný mezi glykosylačními místy nesl velké glykanové řetězce přesahující až 25 manosových zbytků. CAO enzymy, aminoxidasy ze semenáčků hrachu a čočky (PSAO a LSAO), byly purifikovány jako nativní proteiny z jejich přírodních zdrojů. MS a MS/MS data jasně demonstrovala vázání paucimanosových a hybridních N-glykanových struktur na Asn558. Ve třetí části se píše o analýze proteinu pIgA1 simulujícího IgA z pacientů trpících IgA nefropatií (IgAN). Primárním cílem byla identifikace O-glykopeptidů a lokalizace odpovídajících O-glykanů v pantové oblasti (HR) IgA1. Za tímto účelem byl analyzovaný vzorek pIgA1 nejprve separován použitím SDS-PAGE. Vysledný elektroferogram ukázal dva proteinové pásy s molekulovými hmotnosnostmi 63 kDa a 28 kDa, které odpovídaly těžkému a lehkému řetězci IgA1. Protože peptidová sekvence HR obsahovala tři cysteinová residua, bylo nezbytné optimalizovat podmínky redukce/alkylace vzorku pIgA1 s ohledem na separaci SDS-PAGE. To vyústilo v odstranění nežádoucích modifikací peptidů a zlepšilo odezvu signálu analyzovaných O-glykopeptidů. Pás se separovaným těžkým řetězecem IgA1 byl vyříznut z gelu a protein v něm štěpen trypsinem. Získaná peptidová směs separovaná mikrogradientovým zařízením byla dále analyzována MALDI-TOF/TOF MS a MS/MS. Jedna frakce ze vzorku obsahovala směs různých O-glykoforem HR tryptického peptidu. Manuální a softwarová interpretace MS/MS spekter těchto O-glykopeptidů poskytla jednoznačnou lokalizaci všech O-glykosylačních míst v 15 nejvíce zastoupených glykoformách zahrnujících i glykoformy deficientní na galaktosu (Gal). Tyto výsledky představují první přímé stanovení míst mnohočetných O-glykosylací s komplexní heterogenitou v pIgA1 HR použitím MALDI-TOF/TOF MS a MS/M

Abstract:

The introduction of this Ph. D. thesis describes the role of mass spectrometry (MS) in biology and the significance of proteomic in analysis of post-translational modifications (PTMs) of proteins. Further, the thesis deals with post-translational modifications of proteins, especially N- and O-glycosylation. It describes the importance of N- and O-glycans and some strategies of their analysis by MS. The experimental part is divided into three sections: 1) An overview of methods, 2) Analysis of N-glycosylation in plant proteins, and 3) Analysis of O-glycosylation in the hinge-region (HR) of polymeric myeloma immunoglobuline alpha 1 (pIgA1). The first part describes a strategy of analytical workflow and deals with a majority of methods that have been used (especially a microgradient device). In the second part, studies on several plant glycoproteins cytokinin oxidase/dehydrogenase (CKO; EC 1.5.99.12) and copper-containing amine oxidases (CAOs; EC 1.4.3.22, formely EC 1.4.3.6) are introduced. An enzymatic deglycosylation of CKO and CAOs by endoglycosidase H under denaturing conditions combined with their proteolytic digestion by trypsin was carried out in order to analyze both N-glycans and "trimmed" N-glycopeptides with a residual N-acetylglucosamine attached at the originally occupied N-glycosylation sites. The released N-glycans were subjected to a manual chromatographic purification followed by MALDI-TOF/TOF MS and MS/MS (matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry and tandem mass spectrometry). Tryptic N-glycopeptides (in the case of CAOs also other proteases were used) were either measured directly with MALDI-TOF MS or separated by use of revesed-phase liquid chromatography (RPLC) and subsequently analyzed by MALDI-TOF/TOF MS and MS/MS. The RPLC separation by use of a simple microgradient device provided simplification of a glycopeptide mixture and resulted in an improved analysis of glycosylation modifications. Recombinant maize CKO isoenzyme 1 (ZmCKO1) expressed in Yarrowia lipolytica contained 9 potential N-glycosylation sites. Glycopeptide sequencing confirmed N-glycosylation at Asn52, 63, 134, 294, 323 and 338. Interestingly, Asn338 was the sole site to carry large glycan chains exceeding 25 mannose residues. CAO enzymes, pea and lentil seedling amine oxidases (PSAO and LSAO, respectively) were purified as native proteins from their natural sources. MS and MS/MS data clearly demonstrated binding of paucimannose and hybrid N-glycan structures at Asn558. The third part describes analysis of a pIgA1 protein simulating IgA from IgA nephropathy (IgAN) patients. The primary aim was to identify O-glycopeptides and to determine the localization of the corresponding O-glycans in the HR of IgA1. For this purpose, the analyzed sample of the pIgA1 was first separated by use of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The resulting electropherogram showed two protein bands with apparent molecular masses of 63 kDa and 28 kDa that correspond to heavy and light chain of IgA1. Because the peptide sequence of the HR contained three cysteine residues, it was also necessary to optimize the reduction/alkylation procedure of the pIgA1 sample with the respect to the SDS-PAGE separation. This resulted in removal of undesired peptide modifications and substantially improved signal response of analyzed O-glycopeptides. The gel band containing separated heavy chain of IgA1 was excised from the gel and in-gel digested with trypsin. Then the peptide mixture was separated by the microgradient device and further analyzed by MALDI-TOF/TOF MS and MS/MS. One sample fraction contained a mixture of various O-glycoforms of the HR tryptic peptide. Manual and software interpretation of MS/MS spectra of these O-glycopeptides provided unambiguous localization of all O-glycosylation sites in 15 most abundant glycoforms including the glycoforms deficient in galactose (Gal).

Keywords

glykoproteomika, posttranslační modifikace, glykosylace, hmotnostní spektrometrie, mikrogradientová separace

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2014

Accessible from:: 10. 5. 2014

Thesis defence

• Supervisor: Prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry