Analýza klonálního přeskupení IgH a TCR receptorů v diagnostice lymfoproliferativních onemocnění z bioptických vzorků

Mgr. Michaela ŠVÁCHOVÁ

Doctoral thesis

Analysis of IgH and TCR Clonal Rearrangements in the Diagnosis of Lymphoproliferative Disorders in Biopsy Samples

Abstract:

Ke stanovení správné diagnózy maligních lymfomů je důležité rozlišení mezi reaktivní a neoplastickou proliferací. Metoda PCR slouží k detekci klonálních přestaveb genů těžkého řetězce imunoglobulinu a T-buněčného receptoru u lymfoidních malignit ze vzorků DNA, extrahované z formalínem fixované a do parafinu zalité tkáně (FFPE). Ve většině případů lymfoproliferativních onemocnění dochází k neoplastické tranformaci po přeskupení genových segmentů, a proto všechny dceřinné buňky vykazují identický profil přeskupení. Tohoto markeru se využívá právě k detekci klonality u lymfoprolifertaivních onemocnění. Prvním cílem této dizertační práce byla optimalizace metody PCR a také dalších souvisejících metod vyšetření, včetně extrakce DNA z FFPE, optimalizace kontrolní PCR, hetroduplexní analýzy, elektroforetické separace PCR produktu a barvicí techniky. V neposlední řadě pak byla důležitá správná intrepretace výsledků. Hlavním cílem práce bylo využití zavedené metody pro vlastní diagnostiku lymfoproliferativních onemocnění v naší laboratoři. Metodou PCR bylo vyšetřeno celkem 957 bioptických vzorků. Nejpočetnější skupinu představovala vyšetření 393 mízních uzlin a 218 vzorků kůže. Další vyšetření byla provedena z početně různě zastoupených vzorků tkání: kostní dřeně, mediastina, žaludku, střev, příušních žláz, dutiny ústní, nosohltanu, mandlí, sleziny, štítné žlázy, spojivky, mammy, prostaty, plic, jatek a konečníku. Z celkového počtu 957 bioptických vzorků, bylo vyšetřeno 544 případů z B buněk a 413 z T buněk. Souběžné vyšetření IgH a TCR bylo provedeno u 240 vzorků. Monoklonalita byla zjištěna u 437 vzorků (295 z B buněk a 142 z T buněk), zatímco 316 vzorků bylo definováno jako non-neoplastické léze, z velké části reaktivního typu (180 z B buněk a 136 z T buněk). B lymfomy byly rozděleny podle WHO klasifikace do šestnácti skupin. Z celkového počtu 295 diagnostikovaných maligních lymfomů bylo klonální přeskupení prokázáno ve 235 případech (79,7%). Ve skupině T lymfomů bylo vyšetřeno třináct typů. Ze 142 případů maligních lymfomů bylo klonální přeskupení detekováno u 90 z nich (63,4%). Z výsledků této dizertační práce vyplývá, že PCR detekce přeskupení IgH a TCR genů je vhodnou metodou pro analýzu klonality B a T buněk z FFPE tkáně. Napomáhá patologům k přesnějšímu stanovení správné diagnózy lymfoproliferativních onemocnění, kdy jsou morfologická a imunohistochemická vyšetření nejednoznačná. Správná diagnóza je nezbytným předpokladem k úspěšnému zahájení léčby pacientů.

Abstract:

Distinction of reactive proliferations from neoplastic transformation is very critical for diagnosis of malignant lymphomas. The PCR method is used for detection of clonal rearrangements of the immunoglobulin heavy chain (IgH) and T-cell receptor (TCR) genes in lymphoid malignancies from DNA samples extracted from formalin-fixed, paraffin embedded tissues (FFPE). In the majority of cases, lymphoproliferative disordes are characterized by gene rearrangements after neoplastic transformation. All daughter cells then show an identical rearrangement profile. This marker is often used for clonality detection in lymphoproliferative disorders. The first aim of the doctoral thesis was optimization of PCR and another related methods, such as DNA extraction from FFPE, control PCR for assessment of DNA integrity, heteroduplex analysis, electrophoresis of PCR products and staining techniques. Of course, very important is correct clinical interpretation of the obtained results. The main goal of the thesis was implementation of the optimized PCR method for diagnosis of lymphoproliferative disorders in our laboratory. A large cohort of 957 samples was analyzed. The cohort consisted of 393 lymph nodes, 218 skin samples and lesser number of other tissues such as bone marrow; mediastinum, stomach, intestine, parotid glands, mouth cavity, nasopharynx, tonsils, spleen, thyroid glands, conjunctiva, breast, prostate, lung, liver and rectum. From a total of 957 FFPE tissues with no definite diagnosis examined by PCR methods 544 were from B-cells and 413 from T-cells Both IgH and TCR analyses were performed simultaneously on 240 samples. Malignant diseases were represented by 437 samples (295 from B-cells and 142 from T-cells) while 316 samples were defined as non-neoplastic lesions of a largely inflammatory and reactive type (180 from B-cells and 136 from T-cells). In conclusion, the results of this study corfirm that PCR amplification of IgH and TCR rearrangement genes is a reliable method for detection of B- and T-cell clonality from FFPE tissue. In particular, molecular methods significantly improve the ability of pathologists to more accurately determine the correct diagnosis of lymphoid neoplasia in specimens in which histological and immunophenotypic studies are inconclusive. The correct diagnosis is a prerequisite for successful initiation of the patient treatment patient.

Keywords

klonalita, přeskupení IgH a TCR genů, lymfoidní proliferace, polymerázová řetězová reakce, BIOMED-2.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 1. 2015

Accessible from:: 26. 1. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 27. 2. 2015

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Biology / Medical Biology