Nové mikroskopické metody pro studium rostlinného cytoskeletu

Mgr. Petra ILLÉSOVÁ

Doctoral thesis

New microscopic methods for studies of plant cytoskeleton.

Abstract:

This Ph.D. thesis is focused on the possibilities of studying the plant cytoskeleton using modern microscopic methods such as light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), spinning disk confocal microscopy (SDCM) and Airyscan confocal laser scanning microscopy (CLSM). Microscopic analyses were performed on microtubules (MTs) during cell divisions in the roots of the model species Arabidopsis thaliana and in the roots of the important legume crop Medicago sativa. The thesis is divided into three parts. The first part summarizes the current knowledge about plant cytoskeleton, its structure and function. This part contains chapters focused on the organization and the roles of MTs during the mitosis. In the same section, the chosen model plants are described while an account of the used microscopic methods is also given. The second part is mainly focused on the preparation of plant material for subsequent microscopic analysis of mitotic MT arrays. Mitosis is a highly dynamic process, sensitive to many stress factors. For this reason, the selection of the suitable microscopic method is very important. Using genetically encoded fluorescent MT markers and modern microscopic methods (LSFM, SDCM and Airyscan CLSM) with high spatio-temporal capabilities, it was possible to track and document dynamic processes, such as mitosis, in real time. The third part of thesis is more specified on the use of LSFM to study mitotic MTs in growing M. sativa roots expressing 35S::GFP:MBD construct. Owing to the high optical resolution, efficient optical sectioning, high speed image acquisition, low phototoxicity and ability to scan the sample oriented in a vertical position, this microscopic method is suitable for the 4D long-term live-cell imaging of plant under nearly physiological conditions. In total, nine imaged M. sativa roots were divided into three groups according to their growth rates. In each group we recorded and quantitatively evaluated the duration of the mitotic cell division and specific mitotic MT arrays such as the preprophase band, the mitotic spindle and the phragmoplast in both, the epidermis and the first outer layer of cortex, respectively. Obtained data showed strong correlation between the root growth rate and the duration of cell division in the M. sativa roots.

Abstract:

Předkládaná disertační práce je zaměřena na možnosti studia rostlinného cytoskeletu pomocí moderních mikroskopických metod jako jsou "light-sheet" fluorescenční mikroskopie (LSFM), konfokální mikroskopie s rotujícím diskem (SDCM) a Airyscan konfokální laserová skenovací mikroskopie (CLSM). Mikroskopické analýzy byly provedeny na mikrotubulech v průběhu buněčného dělení v kořenech modelové rostliny Arabidopsis thaliana a v kořenech hospodářsky významné luštěniny Medicago sativa. Práce je rozdělena na tři části, z nichž první část shrnuje ověřené poznatky o rostlinném cytoskeletu, jeho složení a funkci. Tato část také obsahuje kapitoly pojednávající o uspořádání a úloze mikrotubulů (MT) v průběhu mitózy. Dále jsou zde charakterizovány jednotlivé modelové rostliny a základní principy použitých mikroskopických metod. Druhá část práce je zaměřena zejména na přípravu rostlinného materiálu pro následnou mikroskopickou analýzu mitotických MT. Mitóza je velmi dynamický proces, který je citlivý na jakékoliv vnější stresové faktory. Z tohoto důvodu je výběr mikroskopické metody velice důležitý. Využitím fluorescenčně značených MT a moderních mikroskopických metod (LSFM, SDCM a Airyscan CLSM), které jsou dostatečně rychlé, mají vysoké rozlišení a zároveň jsou v průběhu snímání šetrnější k rostlinnému preparátu díky nižší fototoxicitě, jsme schopni studovat tyto dynamické procesy v reálném čase. Třetí část této práce se zaměřuje na využití LSFM při studiu mitotických MT v rostoucích kořenech M. sativa exprimujících 35S::GFP:MBD konstrukt. Zejména díky vysokému optickému rozlišení, možnosti vytváření efektivních optických řezů, vysoké rychlosti snímání, nízké fototoxicitě a možnosti snímání preparátu umístěného ve vertikální poloze je tato mikroskopická metoda vhodná pro dlouhodobé 4D snímání živých rostlinných preparátů při téměř fyziologických podmínkách růstu. Celkem devět snímaných kořenů M. sativa bylo rozděleno do tří skupin podle rychlosti jejich růstu. V každé skupině kořenů jsme zaznamenali a kvantitativně vyhodnotili trvání mitotického buněčného dělení, zejména trvání přítomnosti jednotlivých mitotických mikrotubulárních struktur jako je preprofázní svazek, mitotické vřeténko a fragmoplast a to jak v epidermis, tak v první vrstvě kortexu. Získaná data ukázala průkaznou korelaci mezi rychlostí růstu kořenů a trváním buněčného dělení v kořenech M. sativa.

Keywords

mikrotubuly, Medicago sativa, "light-sheet" mikroskopie, konfokální mikroskopie s rotujícím diskem, Airyscan, Arabidopsis thaliana, preprofázní svazek, dělicí vřeténko, fragmoplast, mitóza

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 6. 2018

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry