Genetické abnormality u solidních nádorů dětského věku: změny karyotypu a klonální selekce v průběhu in vitro kultivací

Bc. Jan Škoda, Ph.D.

Master's thesis

Genetic abnormalities in pediatric solid tumors:changes in karyotype and clonal selection during in vitro cultivaton

Abstract:

Nádorové buněčné linie představují zavedený experimentální model, na kterém lze detailně sledovat dynamiku patogeneze nádoru, testovat účinek potenciálních léčiv a také podrobněji definovat případné diagnostické markery. Výsledky získané na dlouhodobě kultivovaných buněčných liniích jsou však často zpochybňovány z důvodu jejich nedostatečné validity vzhledem k podmínkám, ve kterých kancerogeneze probíhá in vivo. Cílem předkládané práce bylo proto charakterizovat genetické abnormality na souboru 3 buněčných linií derivovaných ze solidních nádorů dětského věku, ověřit jejich změny během kultivace in vitro a porovnat spektrum prokázaných aberací s výsledky klinické diagnostiky. Pro tyto účely byly uplatněny metody G-pruhování, FISH a doplňkově SKY. Součástí práce je proto optimalizovaný protokol přípravy metafázních preparátů ze solidních nádorů a dále jsou diskutovány metodické limity, které metafázní cytogenetiku solidních nádorů doprovází. Buněčné linie použité v této práci byly derivovány z neuroblastomu (NBL-15), multiformního glioblastomu (HGG-02) a osteosarkomu (OSA-05). U všech linií byla prokázána korelace cytogenetických nálezů s výsledky klinické diagnostiky, přestože ne absolutní. Během kultivace docházelo u vysoce aneupolyploidní HGG-02 k rozsáhlým změnám na úrovni karyotypu. Naopak „near-diploidní“ linie OSA-05 i NBL-15 byly v průběhu kultivace stabilní a heterogenita buněčné populace byla podstatně nižší ve srovnání s HGG-02. To dokazuje, že stabilita dlouhodobě kultivovaných buněčných linií závisí na stabilitě jejich genomu. Bylo prokázáno, že přestože linie HGG-02 podléhala klonální selekci a během kultivace se navyšoval počet buněk s delecí EGFR, heterogenita celé buněčné populace byla stále stejně vysoká. Tento výsledek potvrzuje, že klonální selekce je spojena s klonální divergencí, která průběžně generuje další buněčné varianty. Nález delece EGFR u HGG-02, který byl následně potvrzen i u parafinového řezu nádorem, představuje dle dostupné literatury první zaznamenaný případ delece tohoto genu u multiformního glioblastomu. S ohledem na dlouhé přežití pacienta by měl být případný prognostický význam této aberace dále ověřen.

Abstract:

Cancer cell lines represent well-established experimental model, which can be used for detailed studies of cancer pathogenesis, for testing of potential drugs and also for identification of prospective diagnostic markers. However, the results based on long-term cultivation of cell lines are often disputed because of lacking validity considering the conditions, in which cancerogenesis takes place in vivo. Therefore, the objective of the presented thesis was to characterize genetic abnormalities on a set of 3 cell lines derived from childhood solid tumors, to verify their changes during in vitro cultivation and to compare these findings with the results of clinical diagnostics. The methods of G-banding, FISH and additionally SKY were employed for these purposes. Optimized protocol of metaphase specimens preparation from solid tumors is included as a part of this thesis. Limits of these methods with regard to solid tumors are also discussed. The employed cell lines were derived from neuroblastoma (NBL-15), glioblastoma multiforme (HGG-02), and osteosarcoma (OSA-05). Correlation of cytogenetic findings with the results of clinical diagnostics has been found in all cell lines, though not absolute. Extensive changes have been observed during the cultivation in highly aneupolyploid HGG-02. On the other hand, near-diploid cell line OSA-05, as well as NBL-15 were stable and cell heterogeneity was significantly lower comparing to HGG-02 cell line. This result shows that stability of long-term cultured cell lines depends on their genome stability. It was also demonstrated that although HGG-02 was under clonal selection and the number of cells with EGFR deletion increased during the cultivation, heterogeneity of whole cell population was permanently high. This result proves that clonal selection is linked to the clonal divergence, which continuously generates another cell variants. Finding of EGFR deletion in HGG-02 that was subsequently confirmed also on parrafin-embeded tissue sections from the respective tumors, is according to available literature the first evidence of EGFR deletion in glioblastoma multiforme. Considering the long patient's survival, prognostic importance of this aberration should by verified in next studies.

Keywords

solidní nádor, dětství, buněčná linie, klonální selekce, genetická heterogenita, metafázní cytogenetika, karyotyp, multiformní glioblastom, neuroblastom, osteosarkom. solid tumor, childhood, cell line, clonal selection, genetic heterogeneity, metaphase cytogenetics, karyotype, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, osteosarcoma.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular Biology and Genetics