Human Embryonic Stem Cells: Cell Cycle Regulation and Reaction to DNA damage

Mgr. Tomáš Bárta, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Lidské embryonální kmenové (EK) buňky nacházejí uplatnění v mnoha biomedicínských aplikacích. Avšak než bude možné plně využít jejich potenciál, je zapotřebí zcela pochopit jejich biologii. Schopnost EK buněk udržovat si pluripotentní stav během kultivace in vitro vyžaduje unikátní konfiguraci molekul, které regulují buněčný cyklus. Molekulární mechanismy, které umožňují EK buňkám uchovávat si jejich nediferencovaný stav a zároveň rychle proliferovat, nebyly doposud uspokojivě popsány. Bylo prokázáno, že cyklin-dependentní kinázy (CDK), klíčové molekuly v řízení buněčného cyklu, hrají v lidských EK buňkách důležitou roli při uchovávání pluripotentního stavu, symetrického dělení (sebeobnově) a v reakci na poškození DNA. Tato studie se zaměřuje na roli CDK2 v řízení buněčného cyklu a odpovědi na poškození DNA u lidských EK buněk. Imunoprecipitační a imunofluorescenční experimenty ukázaly, že CDK2 tvoří komplex s cyklinem B1. Komplex CDK2/cyklin B1 vykazuje kinázovou aktivitu, která kolísá v průběhu buněčného cyklu a svého maxima dosahuje ve G2/M fázi. Snížení exprese obou komponent komplexu CDK2/cyklin B1 vedlo k akumulaci lidských EK buněk v G2/M fázi, což ukazuje na velmi důležitou roli CDK2/cyklin B1 v regulaci mitózy. Tato studie se dále zaměřuje na roli CDK2 v regulaci G1/S kontrolního bodu buněčného cyklu. Po ozáření lidských EK buněk UVC zářením v G1 fázi buněčného cyklu dochází k rychlému snížení aktivity CDK2 a následně k akumulaci lidských EK buněk v G1 fázi. Snížení aktivity CDK2 je způsobeno rychlou degradaci Cdc25A fosfatázy, avšak bez přispění p53-p21 signální dráhy. Data prezentovaná v dizertační práci popisují klíčovou úlohu CDK2 při řízení buněčného cyklu a v reakci na poškození DNA v lidských EK buňkách.

Abstract:

Human embryonic stem (hES) cells hold great promise in many biomedical applications including cell replacement therapy, drug screening and developmental studies. However, before the full potential of these cells can be applied, we must deeply understand the biology of these cells. Particularly, the cell cycle regulation and genome integrity maintenance is very important for eliminating concerns regarding hES cells utilization. Embryonic stem cells progress very rapidly through the cell cycle, allowing limited time for cell cycle regulatory circuits that typically function in somatic cells. It has been previously shown that cyclin‐dependent kinases (CDK), key molecules involved in the cell cycle regulation, provide a link between pluripotency, selfrenewal and DNA damage response in hES cells. Especially, CDK2 emerged as central molecule in controlling self‐renewal, cell‐fate decision and DNA damage response. Here we show that CDK2 is active throughout the cell cycle progression of undifferentiated hES cells. In G2/M phase of the cell cycle CDK2 associates with cyclin B1 to act like CDK1. We also describe the role of CDK2 in DNA damage response. UVC irradiation in G1 phase of the cell cycle causes delay in G1/S transition of hES cells and reduction of CDK2 activity. Such delay is the result of rapid degradation of Cdc25A through the simultaneous action of both Chk1 and Chk2 kinases. Lack of CDK2‐activating Cdc25A results in low CDK2 activity, without contribution from the p53‐p21Cip1 pathway.

Keywords

human embryonic stem cells, cell cycle, cyclin‐dependent kinase, cyclin, DNA damage response, checkpoint, UVC irradiation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 9. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 19. 10. 2012
• Supervisor: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology