Interakce proteinu p53 a jeho homologů s DNA a jejich úloha v maligní transformaci buňky

RNDr. Eva Roubalová, Ph.D.

Doctoral thesis

Interaction of p53 protein and its homolgues with DNA and their role in malignant transformation

Abstract:

Předložená práce se zabývá studiem ovlivnění exprese proteinu p53 platinovým derivátem LA-12 a jeho vlivem na transkripční aktivitu p53 u panelu nádorových buněčných linií s různým statutem p53. Transkripční aktivita proteinu p53 byla studována pomocí detekce proteinů závislých na funkci proteinu p53. Byla provedena srovnávací analýza účinků LA-12 a cisplatiny u buněčných linií ARN8, H1299 a MCF-7. Analyzován byl také účinek cytostatik na posttranslační modifikace proteinu p53. Dále byl v rámci této práce testován vliv LA-12 na buněčný cyklus a na indukci apoptózy. Zkoumáno bylo rovněž spektrum p53 cílových genů, které jsou exprimovány po působení LA 12. V této práci byla analyzována také role isoformy p53/47 v citlivosti buněk k působení LA-12. Výsledky této práce ukazují, že LA-12 indukuje nižší hladinu proteinu p53 než cisplatina, a že tento protein má rovněž nižší transkripční aktivitu. Přesto vykazuje LA-12 silný cytotoxický účinek způsobující indukci stresových drah vedoucích k apoptóze. Schopnost LA-12 vyvolávat apoptózu je spojena s velmi nízkými koncentracemi této substance a její proapoptotický efekt se projevuje v kratším časovém intervalu, což by mohlo být přínosem při zmírňování nežádoucích vedlejších účinků ve srovnání s terapeutickými strategiemi využívajícími jiná platinová cytostatika. Z předložených výsledků vyplývá, že LA 12 zastavuje buněčnou proliferaci nezávisle na statutu p53, pravděpodobně tím, že aktivuje jak na p53 závislé, tak na p53 nezávislé dráhy. Účinek LA-12 je však výrazně vyšší v přítomnosti funkčního proteinu p53. Důležitým zjištěním bylo také to, že v důsledku působení LA-12, cisplatiny a doxorubicinu docházelo nejen ke zvýšení exprese FL p53, ale i isoformy p53/47, která může indukovat apoptózu nezávisle na p53 a může se také podílet na regulaci transkripční aktivity p53. Srovnání účinku cisplatiny a LA-12 ukázalo, že mechanizmus působení těchto látek se liší zejména v jejich vlivu na stabilitu a akumulaci proteinu p53 a také ve spektru p53 cílových genů, jejichž expresi tyto látky indukují. Tyto rozdíly by mohly souviset se strukturálními odlišnostmi mezi těmito sloučeninami a s rozdíly v poškození DNA, které v buňkách vyvolávají. Odlišný mechanizmus účinku LA-12 pravděpodobně souvisí i se schopností LA-12 indukovat buněčnou smrt u buněk rezistentních k účinku cisplatiny a mohl by částečně řešit problém získané rezistence při těchto terapiích. Zjištění, že LA-12 aktivuje jak na p53 závislé, tak na p53 nezávislé dráhy nabízí možnost použití tohoto cytostatika v terapii nádorů postrádajících p53 nebo exprimujících nefunkční mutantní formy p53.

Abstract:

This work investigates the effect of new platinum derivative LA-12 on p53 expression and transcriptional activity in the panel of tumour cell lines with diverse p53 status. p53 transcriptional activity was studied using detection of p53 downstream proteins. The effect of LA-12 was compared to that of cisplatin in ARN8, H1299 and MCF-7 cell lines. We have also analysed the effect of these substances on p53 posttranslational modifications, on cell cycle regulation and on apoptosis induction. Furthermore, we have studied the changes in gene expression following LA-12 and cisplatin treatments. Another aim of this work was to investigate the role of p53/47 isoform in the sensitivity of tumour cells to LA-12 treatment. Result shown here demonstrate that LA-12 treatment induced lower level of p53 accumulation in cells compared to cisplatin, and that this protein had also lower transcriptional activity. Nevertheless, LA-12 showed strong cytotoxic effect on tumour cells by inducing stress pathways leading to apoptosis. LA-12 treatment induced cell death in very low concentrations and after short treatment periods, indicating that LA-12-based therapy could help to reduce harmful side effects, compared to therapeutical strategies utilizing other platinum-based drugs. Data shown here also demonstrate that LA-12 causes cell cycle arrest independently of p53 status, probably by inducing both p53-dependent and p53 independent pathways. Nevertheless, LA-12 effect is stronger in the presence of functional p53. We have also demonstrated that LA-12, cisplatin and doxorubicin treatments increased expression of the p53/47 isoform that is capable of inducing apoptosis independently of FLp53 and that can also be involved in regulation of p53 transcriptional activity. The comparison of cisplatin and LA-12 effects showed that these substances differ in their modes of actions. The differences consist in their effect on stability and accumulation of p53 protein and also in the expression spectra of p53 target genes induced by these drugs. These differences could be ascribed to the structural divergence between LA-12 and cisplatin and consequently to the distinct DNA lesions caused by the two substances. The different mechanism of LA-12 mode of action also presumably bears upon the ability of this drug to induce cell death in cisplatin-resistant cells, signalling that LA-12 could help to overcome the acquired resistance to other platinum based cytostatics. The fact that LA-12 activates both p53 dependent and p53-independent pathways offers the possibility to employ this substance in treatment of tumours lacking p53 and in tumours expressing non-functional mutant p53 proteins.

Keywords

LA-12, cisplatina, cisplatin, p53, p53/47, apoptóza, apoptosis, buněčný cyklus, cell cycle

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 6. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 23. 6. 2009
• Supervisor: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology