Strukturní a funkční charakterizace RNA vazebné domény lidských proteinů IMPDH

Bc. Jan Herudek, PhD.

Master's thesis

Structural and functional characterization of human IMPDH proteins

Abstract:

Inosine-monofosfát dehydrogenasa 1 (IMPDH1) je převážně cytoplazmatický protein zodpovědný za syntézu nukleotidu guaninu de novo. Nedávné studie ukázaly lokalizaci IMPDH1 v jádře buňky, kde je schopna vázat nukleové kyseliny a v případě kvasinek Saccharomyces cerevisiae pravděpodobně interaguje s RNA polymerasou II. Tyto poznatky indikují novou roli tohoto proteinu v buněčném jádře. IMPDH1 vytváří stabilní homotetramer s katalytickým místem pro cytoplazmatickou syntézu GTP a navíc obsahuje cystathionine-β-synthasovou subdoménu (CBS), která je umístěna vně tetrameru. Subdoména CBS navíc obsahuje několik polymorfismů, které korelují s výskytem očního onemocnění Retinitis pigmentosa. Cílem této práce je s využitím strukturních a funkčních nástrojů studovat roli proteinu IMPDH1 v jádře lidských buněk a charakterizovat afinitu subdomény CBS k RNA a DNA. Základními metodami studia jsou Chromatinová Imunoprecipitace (ChIP) spojená s kvantitativní PCR analýzou specifických genomových oblastí, RNA Imunoprecipitace in vivo (CLIP) určená k charakterizaci RNA-vazebných motivů a nukleární magnetická rezonance (NMR) k detailnímu popsání struktury CBS subdomény.

Abstract:

Inosine monophosphate dehydrogenase 1 (IMPDH1) is a predominantly cytoplasmic protein which catalyzes the rate limiting step of the de novo synthesis of guanine nucleotides. However, recent studies showed that IMPDH1 also localizes to the nucleus where it binds nucleic acids and potentially interacts with RNA polymerase II in yeast cells. This suggested an additional role for this protein in the nucleus. IMPDH1 assembles into a homotetramer to form a catalytically active site important for its cytoplasmic function in GTP synthesis. In addition to that it contains the nucleic acids-binding cystathionine β-synthase subdomain (CBS) that protrudes outside the tetramer. Interestingly, mutations in CBS strongly correlate with the occurrence of Retinitis pigmentosa, the inherited eye disease. In vitro, these CBS mutations lower the affinity of IMPDH1 to nucleic acids. By combination of structural and functional approaches, we aim to investigate the nuclear role of IMPDH and the DNA and RNA binding specificity of CBS in human cells. We use Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) followed by quantitative PCR to look for specific interaction with chromatin and the RNA in vivo Cross-linking and Immunoprecipitation (CLIP) to assess RNA-binding specificity, and nucleic magnetic resonance (NMR) to map the interacting CBS surface.

Keywords

metabolismus purinů, IMPDH, RNA polymerasa II, transkripce, jádro, RNA-vázající protein, ChIP, CLIP, purine metabolism, RNA polymerase II, transcription, nucleus, RNA-binding protein

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 14. 6. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biomolecular Chemistry