Studium interakce proteinů rodiny p53 s DNA modifikovanou reaktivními skupinami pro kovalentní biokonjugace

Bc. Eva Čechová

Bachelor's thesis

A study of p53-family protein interactions with DNA modified with reactive groups for covalent bioconjugations

Abstract:

V této práci jsme se zabývali přípravou specificky modifikovaných DNA pro následné biokonjugace s DNA-vazebnými proteiny rodiny p53. Pomocí enzymatické inkorporace (PEX) s využitím 2´-deoxycytidin trifosfátu s konjugovaným propargylvinylsulfonamidem (PVS) byly připraveny značené DNA substráty, které obsahovaly cíleně PVS-modifikovanou p53-vazebnou sekvenci. Radioaktivně značené DNA substráty byly inkubovány s proteiny p53, p63 a p73 (exprimované jako GST-fúzní konstrukty s centrální vazebnou doménou) a poté analyzovány pomocí nekompetiční EMSA. Bylo prokázáno, že za těchto podmínek se testované proteiny vážou jak na specifickou, tak nespecifickou PVS-modifikovanou sekvenci. Vlastní konjugační reakce byla provedena inkubací reakční směsi při laboratorní teplotě. Po následné mírné denaturaci byla reakční směs analyzována pomocí radioaktivní denaturační PAGE (detekce 32P-značené DNA), a pomocí imunodetekce s využitím specifických protilátek (detekce proteinů). Vznik kovalentních konjugátů byl prokázán na úrovni DNA u PVS-modifikovaných DNA substrátů. Naproti tomu, však nebyl detekován na úrovni proteinu v případě imunodetekce.

Abstract:

In this work we focused on the preparation of site specifically modified DNA for the following bioconjugation DNA-binding proteins of p53 family. Enzymatic incorporation (PEX) using 2´-deoxycitidine triphosphate with conjugated propargylvinylsulfonamide was used for preparation of DNA substrates bearing targeted PVS-modified p53-binding sequence. Radioactive labelled DNA substrates were incubated with p53, p63 or p73 protein (expressed as GST-tagged central DNA binding domain constructs) and first analysed with non-competitive EMSA. Binding of the studied proteins to both specific and non-specific modified DNA sequences under these conditions was confirmed. Conjugation reaction was performed by incubation of reaction mixture at the room temperature. After subsequent mild denaturation the reaction mixture was analysed using radioactive PAGE (to detect 32P-labelled DNA) and with immunodetection using specific antibodies (to detect proteins). Formation of the covalent conjugates was demonstrated on the DNA level at PVS-modified PEX product. However, this was not detected on the protein level in case of performed immunodetection.

Keywords

protein p53, protein p63, protein p73, biokonjugace, enzymatická inkorporace, vinylsulfonamid, DNA, Michaelova adice, nukleosid trifosfát, cystein, bioconjugation, enzymatic incorporation, vinylsulfonamide, Michael addition, nucleoside triphosphate, cysteine

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 4. 2. 2015
• Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry