The use of separation methods for characterization of microorganisms

Mgr. Marie Vykydalová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

V současné době jsou kladeny vysoké nároky na rychlou identifikaci a rozlišení mikroorganismů, především v medicíně, kde přesná a rychlá identifikace patogenu hraje důležitou roli v účinné léčbě pacientů a tak zabraňuje šíření onemocnění a vzniku epidemií. Současné metody, používané k tomu účelu, mají přes nespornou jednoduchost své nedostatky. Mezi ně řadíme časovou náročnost a především neschopnost rozlišení fenotypově blízkých druhů a také biofilm-positivních a biofilm-negativních forem mikroorganismů. Nynější výzkum je proto zaměřen nejen na rychlou identifikaci mikrobiálních kmenů a odlišení jejich biofilmových a planktonických forem. Nové techniky, zejména elektroforetické techniky a hmotnostní spektrometrie s použitím ionizace laserem za přítomnosti matrice v kombinaci s detektorem doby letu, jsou použitelné v oblasti bioanalýzy a mají předpoklady splnit požadavky na rychlost a jednoduchost. Tato práce se věnuje analýze mikroorganizmů pomocí elektroforetických technik. Skládá z části teoretické, která obsahuje základní stručné informace o biofilmech, identifikaci mikroorganizmů, elektroforetických a chromatografických technikách použitých k výzkumu, a části praktické. Ta obsahuje tři odborné články spolu s upřesňujícími komentáři. První článek se zabývá vývojem metody k rozlišení biofilm-pozitivní a biofilm-negativní formy kvasinek skupiny Candida parapsilosis. Candida parapsilosis sensu stricto biofilm-pozitivní forma patří mezi často izolované patogeny u imunodeficitních pacientů s kandidózami. Včasná léčba je rozhodující pro úspěšnou léčbu pacienta. Rozlišení těchto fenotypově blízkých kvasinek je obtížně a rozlišení jejich biofilmových forem je prakticky nemožné. Proto je žádoucí vytvořit rychlou jednoduchou a časově nenáročnou metodu, která by to dokázala a bude použitelná v běžných biochemických laboratořích. Kvasinkové buňky a sonikát s kvasinkami byli nejprve ošetřeny varem. Vzniklý supernatant byl analyzován pomocí mikropreparativní izoelektrické fokusace ve volném roztoku za využití netkané textilie jako separačního lože. Získané roztoky byly analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Kapilární izoelektrická fokusace byla současně použita jako podpůrná a kontrolní technika. Výsledky prezentované v tomto článku naznačují možnost využití kombinace technik mikropreparativní izoelektrická fokusace ve volném roztoku a vysokoúčinné kapalinové chromatografie pro rychlou identifikaci vysoce patogenní biofilm-pozitivní Candidy parapsilosis sensu stricto v reálném klinickém vzorku- sonikátu z cévního katétru. Druhý článek je zaměřen na využití elektromigračních technik a hmotnostní spektrometrie k charakterizaci fenotypově blízkých bakterií. Jako modelové organismy byly vybrány bakterie rodu Rhizobium, konkrétně Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Rhizobium leguminosarum 33 bv. viciae, Rhizobium galegae, Rhizobium loti a Sinorhizobium meliloti na základě odlišného povrchového složení buněk. K analýze byly použity tři typy vzorku-neporušené bakteriální buňky, lyzát z bakteriálních buněk a omytý pellet, což je zbytek vzniklý po lýze buněk. Výsledky ukazují, že použité techniky mají potenciál k rozlišení a charakterizaci fenotypově blízkých bakterií. Bylo také zjištěno, že kombinací použitých technik můžeme získat spolehlivější výsledky. Poslední článek popisuje izoelektrickou fokusaci probiotických bakterií z kravského mléka v kónické křemenné kapiláře. Matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace s analyzátorem doby letu byla použita pro identifikaci bakterií. Rod Lactobacillus byl vybrán jako analyt a kravské mléko jako biologický vzorek. Separační kapacita a účinno

Anotace:

st byly zvýšeny díky použité kónické křemenné kapiláře. Výsledky ukázaly, že navrhovaný postup může sloužit k jednoznačné identifikaci probiotických bakterií v reálném vzorku.

Abstract:

At present, high demands are placed on rapid identification and resolution of microorganisms, especially in medicine where accurate and rapid identification of pathogen plays a crucial role in effective treatment of patients and also prevents spread of diseases and epidemics. Current methods used for this purpose are simple but have their disadvantages. These are usually time-consuming and primarily they cannot distinguish phenotypically close strains as well as biofilm-positive and biofilm-negative forms of microorganisms. Current research is focused on rapid identification of microbial strains and differentiation of their biofilm and planktonic forms. New techniques, in particular electrophoretic techniques and matrix-assisted laser desorption/ionization, are applicable in the field of bioanalysis. They have the capacity to meet the requirements on speed and simplicity. This thesis consists of two parts. First, the theoretical part contains basic brief information about biofilms, identification of microorganisms, electrophoretic methods, and chromatography used for research. The second part is practical. This section is composed of three articles and comments. The first article deals with the development of method for the distinction of phenotypically close yeasts like biofilm-positive and biofilm-negative forms of Candida parapsilosis group. Candida parapsilosis sensu stricto biofilm-positive form belongs to often isolated pathogen from immunocompromised patients with candidiasis. The early diagnosis is crucial for successful therapy of patients. Differentiation of these phenotypically close yeasts is difficult and differentiation of their biofilm forms is practically impossible. Therefore, it is required to create a rapid, simple, and time-saving method which can determine it and which will be applicable in common biochemical laboratories. First, yeast cells and clinical real samples-sonicates were treated by boiling water. Resulting supernatants were desalted and pre-concentrated using new micro-preparative solution isoelectric focusing on non-woven strip. Obtained solutions were analysed by high performance liquid chromatography. Simultaneously, the capillary isoelectric focusing was used as support and control technique. The results presented in this article suggest the possibility of using the combination of micro-preparative solution isoelectric focusing on non-woven strip and high performance liquid chromatography for fast identification of highly pathogenic biofilm-positive Candia parapsilosis sensu stricto in real clinical material-sonicates from vascular catheters. The second article is focused on the use of electrophoretic methods and mass spectrometry for characterization of phenotypically close bacteria. Family Rhizobiaceae, Rhizobacterium leguminosarum bv. trifolii, Rhizobacterium leguminosarum 33 bv. viciae, Rhizobacterium galegae, Rhizobacterium loti, and Sinorhizobium meliloti were selected as model organisms for their different cell surface composition. Three types of samples intact - cells, cell lysates, and „washed pellets” were used for analysis. The results show that the used techniques exhibit potential for differentiation and characterization of phenotypically close bacteria. It was also found that we can acquire better results by the combination of used techniques. The last article described capillary isoelectric focusing of probiotic bacteria from cow’s milk in tapered fused silica capillary. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry was used for identification of bacteria. Genus Lactobacillus was selected as model bioanalyte and cow’s milk was selected as a biological sample. The separation capacity and efficiency of the capillary isoelectric focusing was enhanced due to using tapered fused silica capillary. The results have revealed that the proposed procedure can be advantageously used for unambiguous identification of probiotic bacteria in a real sampl

Keywords

separation methods, electrophoretic techniques, high performance liquid chromatography, microorganisms, biofilm separační metody, vysoko účinná kapalinová chromatografie, elektoforetické techniky, mikroorganizmy, biofilm

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 1. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 1. 2014
• Vedoucí: RNDr. Vladislav Kahle, CSc.
• Oponent: prof. MUDr. Miroslav Votava, CSc., doc. RNDr. Jan Petr, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biochemie