Role of reactive oxygen species in cell differentiation

Mgr. Roman Konopka, Ph.D.

Doctoral thesis

Anotácia:

Úloha reaktivních metabolitů kyslíku (RMK) v organismu je diskutabilní. Jejich nadbytek je škodlivý tím, že reagují a pozměňují všechny druhy buněčných biomolekul, působí cytotoxicky a vyvolávají mutagenezi. Na druhou stranu byl pozorován jejich vliv u řady biochemických a molekulárních procesů jakými jsou proliferace, apoptóza a diferenciace. Proto jsme se rozhodli, že objasníme úlohu RMK v diferenciaci embryonálních kmenových (EK) buněk.V předkládané práci jsme se zabývali následujícími tématy – 1) metodickým přístupem při měření luciferázové aktivity, jakožto reportérového genu; 2) expresí NADPH oxidáz (NOX) v myších EK buňkách; 3) rolí RMK v neuronální diferenciaci embryonální nádorové (EC) linie P19, vyvolané kyselinou retinovou (RA).Abychom byli schopni objasnit procesy probíhající během neuronální diferenciace vyvolané RA, konkrétně aktivaci RARE, vyvinuli jsme efektivní metodu pro stanovení životnosti buněk a luciferázové aktivity v jednom vzorku, bez nutnosti přípravy duplikátů. Výsledky naznačují, že stanovení životnosti buněk metodou měření ATP, může být prováděno společně s měřením luciferázové aktivity, aniž by došlo k jejich vzájemnému ovlivnění. Tento přístup umožňuje lepší reprodukovatelnost výsledků, snižuje počet potřebných opakování a zabraňuje případným chybám v měření. Dále jsme se zabývali sledováním exprese NOX u myších EK linií DBA/252 a D3. Tyto enzymy hrají zřejmě významnou roli v procesech, jakými jsou proliferace a diferenciace. Všechny námi sledované buněčné linie exprimovaly NOX2 a její regulační podjednotky p47phox a p67phox, přičemž vyšší hladina byla detekována u D3 buněk a buněčné linie DBA/252 deficientní pro kinázu p38. Všechny buněčné linie rovněž exprimovaly DUOX2, nejvyšší exprese byla zaznamenána u D3 buněk. V menší míře byla u všech buněčných linií zaznamenána exprese NOX1.V poslední části této práce jsme se zaměřili na funkci RMK v neuronální diferenciaci vyvolané RA. RA zvyšovala intracelulární produkci RMK, což bylo potvrzeno jednak úbytkem thiolových skupin a zároveň výrazným nárůstem tvorby intracelulárních RMK měřeným metodou průtokové cytometrie. „Vychytávači“ RMK společně s flavoproteinovým inhibitorem, snižovali jednak produkci RMK vyvolanou RA, dále aktivitu RARE a v neposlední řadě snížili i expresi N-cadherinu and III-beta tubulinu. Naše data poukazují na úlohu RMK, jakožto významných molekul, v přenosu intracelulárních signálů během neuronální diferenciace pluripotentních embryonálních buněk. Závěrem můžeme dodat, že naše výsledky dokazují, že NADPH oxidázy a jimi produkované RMK mohou hrát zásadní roli v buněčné diferenciaci.

Abstract:

The role of reactive oxygen species (ROS) in organisms is controversial. Excess ROS are harmful because they react with and modify all classes of cellular biomolecules that cause cytotoxicity and mutagenic damage. On the other hand, free radical reactions have been observed to influence molecular and biochemical processes and to directly cause some of the changes observed in cells during proliferation, apoptosis and differentiation. Thus, we decided to elucidate the role of ROS in differentiation of embryonic stem cells (ES). The following aims were examined in this study - 1) the methodological approach in measurement of luciferase activity as a reporter gene; 2) the expression of NADPH oxidases (NOXs) in mouse ES cells; 3) the role of ROS in retinoic acid (RA)-induced neuronal differentiation of embryonal carcinoma (EC) P19 cells. First, for detailed description of processes following the RA-induced neural differentiation, especially the activation of RARE upon RA treatment, we developed an efficient method for determination of cell viability and luciferase activity in one sample with no need of preparing duplicates. The results suggest that the assessment of live cells by determining ATP can be multiplexed with a luciferase reporter gene assay which allows the independent monitoring of both reporter expression and cell viability. This approach allows better reproducibility, a reduction of sample replicates, and prevents any potential misinterpretation of the results. Second, we screened the mouse ES lines DBA/252 and D3 for expression of different types of NOXs, since these enzymes were suggested to play an important role in physiological functions of cells including proliferation and differentiation. All tested cell lines expressed NOX2 enzyme and subunits p47phox and p67phox with higher levels found in D3 cells and p38 kinase deficient DBA/252 cells. All cell lines also expressed DUOX2 with highest relative expression in D3 cells. Tested cells also expressed NOX1, however, weakly. In the last section, we focused on the role of ROS in RA-induced neuronal differentiation of mouse EC cells P19. RA increased the intracellular ROS production that was confirmed by a decrease in thiol groups and significant induction of intracellular ROS measured by flow cytometry. The ROS scavengers and flavoprotein inhibitor reduced RA-induced ROS production, RA-induced activity of RARE, and it decreased the RA-induced expression of N-cadherin and III-beta tubulin. Our data outline a role of ROS as important molecules in transduction of intracellular signals during neuronal differentiation of pluripotent embryonal cells. Taken together, these data demonstrate that NOX family of NADPH oxidases and subsequent ROS formation may play a crucial role in the determination of cell fate.

Keywords

Free radicals, Differentiation, NADPH oxidases, Embryonal carcinoma cells, Neural differentiation, Redox status, Antioxidants Volné radikály, Diferenciace, NADPH oxidázy, Embryonální nádorové buňky, Neurální diferenciace, Redoxní stav, Antioxidanty

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 6. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 8. 2009
• Vedúci: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc., doc. RNDr. Jan Hrbáč, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Animal Physiology