Výpočtové predikce konformačních změn proteinů a jejich interakční vlastnosti mohou být relevantní u neurodegenerativních onemocnění

Krishnendu Bera, Ph.D.

Doctoral thesis

Computational predictions of protein conformational changes and their interaction properties possibly relevant in neurodegenerative diseases

Abstract:

Hlavním cílem této disertační práce bylo, pomocí výpočetních prostředků, objasnit konformační změny a interakční vlastnosti vybraných proteinů, jež jsou významné u neurodegenerativních onemocnění. Disertační práce je rozdělena do tří částí. V první části práce jsem studoval vliv mnohočetné fosforylace na konformační změny a interakce několika protein-peptidů relevantních pro neurodegenerativní onemocnění. Konformační změny fragmentů lidského tau(210-240) v důsledku mnohonásobné fosforylace, byly studovány pomocí simulace molekulární dynamiky (MD). Lidský protein tau je vnitřně neuspořádaný protein (IDP), který stabilizuje axonální mikrotubuly, v mozcích pacientů s Alzheimerovou chorobou se tyto proteiny primárně nacházejí v agregovaných a hyperfosforylovaných formách. Provedl jsem simulace MD v mikrosekundových časových škálách pomocí parametrů silového pole CHARMM36m (C36m) a AMBER99SB-ILDN (A99) ve vodních modelech TIP4PD a validoval jsem výsledky simulace MD s parametry NMR (chemické posuny a 3JHN‐Hα vazba). Zjistil jsem, že vícenásobná fosforylace způsobuje nalomenou/kompaktní konformaci fragmentu tau(210-240) v důsledku tvorby intramolekulárních silných solných můstků, na rozdíl od nefosforylovaného fragmentu tau(210-240), který preferuje lineární konformaci. Nalomená/kompaktní konformace fragmentu tau(210-240) a jeho celkové zvýšení záporného náboje v důsledku mnohonásobné fosforylace, může 12-krát snížit jeho vazebnou afinitu k doméně SH3 můstkového integrátorového proteinu 1 (BIN1). Pomocí MD simulace v kombinaci s výsledky ITC jsem také zjistil, že mnohočetné fosforylace (pT212, pS214 a pT217) ve fragmentech tau(210-220), modulují interakce s lidským proteinem 14-3-3ζ. Studoval jsem tedy také vliv mnohočetné fosforylace (pS19 a pS40) na regulační doménu lidské tyrosinhydroxylázy (RD-hTH1) s lidským proteinem 14-3-3ζ. Protein hTH je enzym s omezenou rychlostí, jež se vyskytuje v biosyntéze dopaminu a adrenalinu, a je spojen s několika neurodegenerativními onemocněními, jako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba atd. Na základě mých simulačních studií MD jsem zjistil, že mnohočetná fosforylace moduluje vazbu RD-hTH1 s 14-3-3ζ, což bylo dobře podloženo získanými experimentálními výsledky. Ve druhé části práce jsem studoval interakci malých organických molekul s vybranými proteiny. 1391 FDA schválených molekul léčiva o specifické velikosti (< 2000) bylo zakotveno na dimerním rozhraní lidského 14-3-3ζ homodimerního proteinu. Osmnáct léků bylo vybráno pro další experimenty na základě získaných hodnot dokovacích vazebných skóre. Následně byly provedeny MD simulace pro těchto vybraných 18 léčiv/14-3-3ζ komplexů. Nakonec bylo vybráno šest léků na základě předpokládaných volných vazebných energií MM/GBSA. V jiné studii jsem se zabýval interakcí potravinářských barviv (Sunset Yellow a Ponceau 4R) s proteinem lysozym získaným z bílku kuřecího vejce (Lyz). Tato studie odhalila destabilizovaný účinek vybraných potravinářských barviv na protein Lyz v důsledku tvorby silných intramolekulárních vodíkových vazeb. Moje výpočetní předpovědi byly experimentálně potvrzeny elektronovou mikroskopií, spolu s mým spolupracovníkem jsme pozorovali vliv těchto potravinářských barviv na vznik amyloidních fibril složených z proteinu Lyz. V rámci boje s pandemií COVID-19 a naléhavou potřebou potenciálních inhibitorů pro cíle SARS CoV-2 jsem provedl screening vybraných antivirových léků schválených FDA proti dvěma proteázám SARS CoV-2, tj. proteáza podobné papainu (PLpro) a 3-chymotrypsinu podobná proteáza (3CLpro). Nejlépe hodnocené funkční molekuly dle vazebné energie, získané z molekulárního dokování, byly dále testovány MD simulací, ana

Abstract:

lýzou hlavních komponent a pomocí výpočtů vazebné volné energie založených na MM/PBSA. Ve třetí části diplomové práce jsem studoval vliv různých molekulových hmotností molekulárního crowderu, polyethylenglykolu (PEG), na rozbalování a sbalování lidského buněčného proteinu, vázajícího kyselinu retinovou I (CRABP I). Protein CRABP I transportuje kyselinu retinovou do jádra a je spojován s různými neurodegenerativními onemocněními, jako je amyotrofická laterální skleróza (ALS) a spinální muskulární atrofie (SMA). PEG byl vybrán tak, aby napodoboval husté buněčné prostředí a odpovídající účinek vyloučeného objemu na skládání proteinu. Z mé simulace MD a experimentálních výsledků, poskytnutých mým spolupracovníkem, jsme vypozorovali, že PEG chrání rozvinutí CRABP I (močovinou) a zvyšuje rychlost opětovného skládání proteinu CRABP I. V závěru jsou shrnuty hlavní výsledky získané během mého doktorandského studia a poskytují perspektivu pro budoucí studium.

Abstract:

The main aim of this dissertation thesis was to elucidate the conformational changes and the interaction properties of selected proteins that have relevance in neurodegenerative diseases by computational means. The thesis is divided into three parts. In the first part of the thesis, I have studied the impact of multiple phosphorylation on the conformational changes and interactions of several protein-peptides relevant to neurodegenerative diseases. The conformational changes of the human tau(210-240) fragments due to multiple phosphorylation have been studied using molecular dynamics (MD) simulation. The human tau protein is an intrinsically disordered protein (IDP) that stabilizes the axonal microtubule, and in Alzheimer's patients' brains, these are primarily found in aggerated and hyperphosphorylated forms. I have performed MD simulations in microseconds time scales using CHARMM36m (C36m) and AMBER99SB-ILDN (A99) force field parameters in TIP4PD water models and validated the MD simulation results with NMR parameters (chemical shifts and 3JHN‐Hα coupling). I found that the multiple phosphorylation is causing the bent/compact conformation of the tau(210-240) fragment due to the formation of intramolecular strong salt bridges in contrast to the non-phosphorylated tau(210-240) fragment that prefers linear conformation. The bent/compact con-formation of the tau(210-240) fragment and its overall negative charge increase due to multiple phosphorylation may decrease its binding affinity to the SH3 domain of bridging integrator 1 protein (BIN1) by 12-fold. Using MD simulation combined with ITC results, I also found that multiple phosphorylations (pT212, pS214, and pT217) within tau(210-220) fragments are modulating the interactions with human 14-3-3ζ protein. I also studied the impact of multiple phosphorylation (pS19 and pS40) at the regulatory domain of human tyrosine hydroxylase (RD-hTH1) with human 14-3-3ζ protein. The hTH protein is a rate-limited enzyme in dopamine and adrenaline biosynthesis and is linked to several neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's, etc. From my MD simulations studies, I found the multiple phosphorylation modulating the binding of RD-hTH1 with 14-3-3ζ, which was well supported by experimental outcomes. In the second part of the thesis, I studied the interaction of small organic molecules with selected proteins. The 1391 FDA-approved drug molecules based on size (≤ 2000) were docked at the dimer interface of the human 14-3-3ζ homodimer protein. Eighteen drugs were selected based on docking binding scores. Subsequently, MD simulations were performed for these 18 drugs/14-3-3ζ complexes. Finally, six drugs were selected based on MM/GBSA predicted binding free energies. In another study, I checked the interaction of food colourants (Sunset Yellow and Ponceau 4R) with the chicken egg white lysozyme (Lyz) protein. This study revealed the destabilized effect of these food colourants on Lyz protein due to the formation of strong intramolecular hydrogen bonds. My computational predictions were confirmed experimentally by electron microscopy, where we observed the formation of amyloid fibrils composed of Lyz protein due to these food colourants by my collaborator. To combat the COVID-19 pandemic and the urgent need for potential inhibitors for SARS CoV-2 targets, I have screened selected FDA-approved antiviral drugs against two proteases of SARS CoV-2, i.e., Papain-like protease (PLpro) and 3-chymotrypsin-like protease (3CLpro). The best-scoring function-based binding energy molecules obtained from molecular docking were further tested by MD simulation, principal component analysis, and MM/PBSA based binding free energy calculations. In the third part of the thesis, I studied the impact of various molecular weights of molecular crowder, the polyethylene glycol (PEG), in the unfolding and refolding of human cellular retinoic acid-binding protein 1 (CRABP I) protein. The CRABP I prot

Abstract:

ein transports the retinoic acid into the nucleus and is associated with various neurodegenerative diseases, such as Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and spinal Muscular Atrophy (SMA). The PEG was selected to mimic the cellular dense environment and the corresponding impact of excluded volume on protein folding. From my MD simulation and experimental outcomes provided by my collaborator, we have observed that the PEG protects the CRABP I unfolding (by urea) and increases the refolding rate of CRABP I protein. In conclusion part, the main results obtained during my PhD study are summarized and provide perspective for future studies.

Keywords

Simulace molekulární dynamiky, Molekulární dokování, Metadynamika, MM/PBSA, MM/GBSA, Neurodegenerativní onemocnění, Interakce proteinů a proteinů, Tau, 14-3-3 Molecular Dynamics Simulation, Molecular Docking, Metadynamics, Neurodegenerative Diseases, Protein-protein interactions, 14-3-3

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 1. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 30. 4. 2024
• Supervisor: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Reader: Mgr. Stanislav Kozmon, Ph.D., prof. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D., Diego M. Bustos, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Life Sciences