The Consequences of CK1ε-induced Phosphorylation of the Selected Components of the WNT/β-catenin Pathway: Structural Biology Point of View

Mgr. Jakub Harnoš, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Všechny aspekty buněčné fyziologie jsou ovlivňovány signálními drahami. Jednou z nich je i WNT signalizace, která se podílí na procesech jako embryonální vývoj, zachování homeostázy organismu anebo řízení kmenovosti. Není proto překvapující, že dysfunkce nebo deregulace této signalizace vede k poruchám vývoje organismu a může přispívat ke vzniku zhoubného bujení. WNT signalizace se dělí na: i) větev kanonickou, která je závislá na cytoplasmatickém proteinu β-kateninu a ii) větev nekanonickou, do níž patří dráhy, jež jsou na β-kateninu nezávislé. Aktivace jednotlivých větví této signalizace vede k velmi různorodým důsledkům: aktivace kanonické větve ovlivňuje proliferaci a diferenciaci buněk regulací transkripce, zatímco nekanonické dráhy ovlivňují zejména migraci buněk pomocí regulace cytoskeletu. Kasein kináza 1 epsilon (CK1ε) je jedna z nejlépe popsaných kináz v rámci WNT signalizace a bylo prokázáno, že má nezbytnou roli v obou větvích signalizace. Axin a Dishevelled (DVL) patří do skupiny tzv. „scaffold“ proteinů (angl. lešení), které navíc jsou schopny interagovat s kinázou CK1ε. Je pozoruhodné, že navzdory tomu, že patří do stejné skupiny, mají tyto dva „scaffold“ proteiny protichůdné role v kanonické větvi WNT signalizace: zatímco Axin slouží jako centrální molekula tzv. destrukčního komplexu, protein DVL je jeden z klíčových faktorů, které tento komplex inhibují a vedou k jeho rozpadu. Prvním cílem předkládané práce bylo zmapovat interakční rozhraní vybraných vazebných partnerů proteinu Axin (včetně CK1ε) a dále jsme se pokusili více popsat pohledem strukturní biologie vztah mezi výše zmíněnými molekulami, tj. CK1ε, Axin, DVL. Druhým cílem této práce bylo popsání a monitorování konformačních změn proteinu DVL in vivo po aktivaci kinázou CK1ε. Je zajímavostí, že ve všech dosud známých WNT dráhách probíhá přenos signálu přes membránový receptor Frizzled (FZD) a intracelulární fosfoprotein DVL. Genetickými studiemi bylo prokázáno, že protein DVL je zcela nezbytný pro přenos signálu ve WNT signalizaci a že funguje jako přepínač mezi jednotlivými WNT drahami. Dosud však nebyly popsány molekulární mechanismy, kterými je tento proces řízen, a je tudíž zásadní identifikovat molekulární děje, které rozhodují o aktivaci těchto rozdílných drah na úrovni proteinu DVL. V této části předkládané práce jsme sestrojili několik tzv. FRET/FlAsH sond, ve kterých protein DVL obsahoval na N-konci proteinu jeden fluorofor (Azurový fluorescenční protein – ECFP) a na několika vnitřních místech aminokyselinovou sekvenci Cys-Cys-Gly-Pro-Cys-Cys (tzv. tetracysteinová značka), která po smíchání a rozeznání molekulou FlAsH vytvoří fluorofor druhý. Metoda FRET/FlAsH umožňuje místně-specifické značení proteinů v živých buňkách a může být aplikována na širokou škálu proteinů a biologických problémů. Další výhoda této metody spočívá v tom, že vnitřní tetracysteinová značka je natolik malá oproti jiným fluorescenčním značkám, že by pravděpodobně vůbec neměla interferovat s přirozenou funkcí dotyčného proteinu. Několika studiemi bylo ukázáno, že protein DVL se s nejvyšší pravděpodobností může přeskupit do několika konformací v závislosti na očekávané funkci. Tyto konformační změny mohou umožňovat vazbu neuspořádaných oblastí se strukturními doménami (intramolekulární interakce). Pomocí našich FRET/FlAsH sond jsme se snažili studovat intramolekulární interakce a ukázali jsme, že jejich vznik je ovlivněn fosforylacemi indukovanými kinázou CK1ε a že dále umožňují proteinu DVL zaujmout tzv. „otevřené“ a „uzavřené“ konformace. Změnami konformace by v konečném důsledku mohl být vysvětlen mechanismus přepínán

Abstract:

í signálu mezi jednotlivými WNT drahami a tyto znalosti by mohly být použity pro vývoj léčiv na bázi molekulových inhibitorů/aktivátorů, které by v závislosti na daném kontextu WNT signalizaci inhibovaly či aktivovaly. Jako poslední téma této dizertační práce byl membránový receptor FZD. Jak bylo zmíněno výše, tento receptor se účastní iniciace signálu po vazbě WNT ligandu ve všech WNT drahách. My jsme se konkrétně zaměřili na fosforylační „mapu“ receptoru FZD6 a objevili jsme unikátní role proteinů CK1ε a DVL při těchto post-translačních modifikacích. Jelikož FZD6 patří mezi klíčové komponenty nekanonické dráhy WNT/Planární buněčné polarizace (WNT/PCP), tyto výsledky naznačují, že fosforylace tohoto receptoru by mohly sloužit jako nástroj pro lokalizaci v procesu buněčné asymetrie.

Abstract:

WNT signaling represents a set of several transduction pathways crucial for the most fundamental biological processes such as embryonic development, organism homeostasis or stem cell maintenance. Not surprisingly, dysfunction or deregulation of WNT signaling has been linked to an etiology of developmental defects, inherited diseases and many types of cancer. The activation of individual WNT pathways has diverse impacts: the canonical (β-catenin-dependent) branch typically controls cell proliferation and differentiation by the regulation of target genes transcription, whereas the (β-catenin-independent) non-canonical branch typically regulates cell polarity and migration by the reorganization of cytoskeleton. Casein kinase 1 ε (CK1ε) is one of the best described kinases in the WNT signaling, acting in both branches. Axin and Dishevelled (DVL) are two important scaffold proteins in the WNT/β-catenin pathway, which have been also shown to interact with CK1ε. Interestingly, proteins Axin and DVL exhibit opposite functions in the WNT/β-catenin pathway: Axin serves as a key component of the β-catenin “destruction complex” leading to the attenuation of the pathway activity, whereas DVL mediates dissolution/inhibition of the “destruction complex” upon the pathway activation. The first aim of our work was to map the interaction interfaces of the selected partners of human Axin1 (including CK1ε) and then we attempted to shed light on the relationship between CK1ε, Axin and DVL. Additionally, it has been demonstrated that WNT signals in both branches are transduced via membrane receptor Frizzled (FZD) and intracellular protein DVL. There is a strong agreement originating from genetic experiments in Drosophila and mouse that DVL protein plays a crucial role as a signaling hub of WNT pathway. In the second part of this project we established methodology to study the dynamics of DVL conformation in the living cells. We designed, generated and subsequently in vivo tested the series of FRET sensors, which are based on the novel techniques of double-tagging of single DVL molecule with the FRET pair composed of the N-terminally tagged CFP (Cyan Fluorescent Protein) and small fluorescent FlAsH molecule, binding short internal CCPGCC tag. Specifically, we aimed to show whether CK1ε-induced phosphorylation of DVL can result in its conformational change. It has been proposed that individual DVL regions are able to establish intramolecular interactions (i.e. the “open” and “close” conformations), which might serve as one of the mechanisms controlling DVL function and WNT signaling. Using our FRET approach, we investigated DVL conformational changes in the canonical WNT pathway after the manipulation with the CK1ε level. In this part of project, we attempted to understand better the mechanism of switching between various modes of WNT signal transduction by the analysis of individual DVL conformations. Understanding how DVL conformation changes upon various WNT stimuli could be in the future used in drug development to inhibit overactive WNT signaling or to bypass WNT loss-of-function in the pathological conditions. Lastly, we focused on the FZD membrane receptor, which initiates WNT signal transduction network in multicellular organisms. Specifically, we investigated the phosphorylation of human FZD6 and identified unique roles of CK1ε and DVL in this process. Since FZD6 is one of the key proteins in the non-canonical WNT/Planar polarity pathway (PCP), this discovery allowed us to propose that phosphorylation of FZD can represent fundamental cue for localizing of the polarized cells during the PCP establishment.

Keywords

WNT signalizace, Kasein Kináza 1 ε (CK1ε), fosforylace, Axin, Dishevelled (DVL), peptidové matice, Försterův rezonanční přenos energie (FRET), WNT signaling, Casein kinase 1 ε (CK1ε), phosphorylation, peptide microarray, Förster resonance energy transfer (FRET)

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 10. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 18. 10. 2018
• Supervisor: doc. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
• Reader: prof.Dr.biol.hum. Uwe Knippschild, Mgr. Marie Macůrková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology