Subcelulární lokalizace markerů nádorových kmenových buněk v buněčných liniích derivovaných z Ewingova sarkomu

Bc. Lenka Jůzová

Master's thesis

Subcellular localization of cancer stem cell markers in cell lines derived from Ewing's sarcomas

Abstract:

Pro Ewingův sarkom je charakteristické pozdní stanovení diagnózy v důsledku asymptomatického průběhu onemocnění, dále přítomnost metastáz již v době diagnózy a rezistence nádorových buněk ke konvenční chemoterapii a radioterapii. V současné době je přijímána hypotéza o existenci specifické populace nádorových buněk, které jsou označovány jako nádorové kmenové buňky (CSCs). Tato malá subpopulace buněk je zodpovědná za vznik nádoru, zakládání vzdálených metastáz a kvůli své chemorezistenci a radiorezistenci je příčinou relapsu nádorového onemocnění po ukončení léčby. CSCs byly u Ewingova sarkomu poprvé detekovány a izolovány v roce 2009 na základě přítomnosti specifického povrchového markeru CD133. Nádorové buňky s odpovídajícím fenotypem vykazovaly vlastnosti typické pro kmenové buňky, tj. schopnost sebeobnovy, diferenciace a tumorigenní potenciál ve funkčních testech in vivo. Tato diplomová práce byla zaměřena na detekci vybraných kandidátních markerů CSCs (CD133, SOX-2 a nestin) v pěti buněčných liniích derivovaných z Ewingova sarkomu metodami nepřímé imunofluorescence, Western blotting a RT-PCR. Výsledky prokázaly, že všechny zkoumané buněčné linie exprimují uvedené markery, avšak četnost exprese jednotlivých markerů se mezi liniemi lišila. Získané výsledky navíc potvrdily vysokou expresi CD133 ve všech liniích a lze tedy říci, že protein CD133 nepředstavuje vhodný marker CSCs pro Ewingův sarkom. Obdobné výsledky byly získany i pro nestin. Jako vhodný marker CSCs se proto jeví pouze SOX-2, což odpovídá dříve publikovaným výsledkům v souvislosti mezi zvýšenou expresí SOX-2 a tumorigenním potenciálem sarkomových buněčných linií. Byla rovněž provedena detailní studie intracelulární lokalizace CD133 a její fosforylované formy: originálním výsledkem této diplomové práce je průkaz kolokalizace fosforylované formy CD133 s mitochondriemi.

Abstract:

Ewing's sarcoma is characterized by late diagnosis because of asymptomatic disease progression, the presence of metastasis at the time of diagnosis and the resistance of tumor cells to conventional chemotherapy and radiotherapy. At present, a hypothesis concerning the presence of a specific subpopulation of cancer cells termed as cancer stem cells (CSCs). This small subpopulation of tumor cells is responsible for tumor initiation, dissemination within the organism and formation of distant metastases, as well as for the tumor relapse after termination of the therapy. CSCs for Ewing's sarcoma were first detected and isolated in 2009 based on the presence of the specific surface marker CD133. Tumor cells with the corresponding phenotype showed the stem cell–specific properties, i.e. capability of self-renewal, differentiation, as well as the tumorigenic potential in the functional in vivo assays. This diploma thesis was aimed at detection of selected putative markers CSCS (CD133/AC133, SOX-2 and nestin) in five cell lines derived from Ewing´s sarcoma using indirect immunofluorescence, Western blotting and RT-PCR. The results showed that each of cell lines expressed all markers mentioned above, but the frequency of cells positive for individual markers differed among these cell lines. The obtained resulst confirmed the high expression of CD133 in all cell lines, and the present CD133 protein is not a adequate marker of CSCs for Ewing´s sarcoma. The same results were also analyzed for expression of nestin. Therefore only SOX-2 appears as a suitable CSCs marker, which corresponds to the previously published results of association between increased expression of SOX-2 and the tumorigenic potential of sarcoma cell lines. A detailed study of intracellular localization of CD133 and its phosphorylated form was detected: the original result of this diploma thesis is evidence of colocalization of the phosphorylated form of CD133 with mitochondria.

Keywords

Ewingův sarkom, nádorové kmenové buňky, CD133, nestin, SOX-2, fosforylovaná forma CD133, pCD133, Ewing sarcoma, cancer stem cells, phosphorylated form CD133

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 8. 6. 2017
• Supervisor: prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics