Využití molekulárních markerů v taxonomii sinic

Bc. Petra HLOUŠKOVÁ

Bakalářská práce

Molecular markers utilization in the taxonomy of cyanobacteria

Anotace:

Molekulární marker je určitá vybraná část DNA, která svou kompozicí vypovídá o příbuznosti jedinců, populací, druhů. Cílem bakalářské práce bylo srovnat možnosti využítí metod založených na molekulárních markerech - 16S rRNA a AFLP v taxonomii vybraných sinic rodu Nodularia a rodů z řádu Oscillatoriales - Phormidium, Geitlerinema, Microcoleus. Dalším záměrem bylo optimalizovat metodu typu single-cell PCR a navrhnout vhodný postup při získávání originálních sekvencí z AFLP fragmentů. V rámci rodu Nodularia studie srovnává bentické druhy N. sphaerocarpa s mořskými a brakickými druhy N. harveyana a N. moravica. Prokázalo se, že druh N. harveyana se odlišuje od ostatních vybraných druhů rodu Nodularia. Vzhledem k rozčlenění fylogenetických stromů bylo navrženo překlasifikovat kmen Nodularia sp. (CCAP 1452/6) jako N. harveyana. A k příhlédnutí na příbuznost k N. moravica přehodnotit kmen N. sphaerocarpa (SAG 50.79) na Nodularia sp. Analýzy vybraných kmenů z řádu Oscillatoriales učinily odlišné závěry. Byla potvrzena polyfyletie rodu Phormidium. Ze sekvencí oblasti genu 16S rRNA vyvozuje studie příbuznost Ph. autumnale a M. vaginatus. Pro následné určování fylogenetických vztahů těchto kmenů navrhuje studovat sekundární strukturu segmentu ITS nebo 11 bp dlouhého insertu na 6. smyčce 16S rRNA. Naproti tomu data získaná technikou AFLP přiřazují k seskupení Phormidium - Microcoleus navíc druhy G. carotinosum a G. pseudoacutissimum a poukazují tím na značnou heterogenitu rodu Geitlerinema. Za jediný dobře definovaný druh studie považuje typový druh G. splendidum a pro další studie doporučuje srovnávat druhy rodu Geitlerinema s G. splendidum. Metoda single-cell PCR byla upravena opakovaným mrazením vzorků v tekutém dusíku. Některé PCR produkty byly následně osekvenovány a použity pro další fylogenetické studie. Využítí této metodiky navíc odstraňuje problémy spojené s kultivací sinic. Dále byla nalezena optimální metodika pro získávání originálních sekvencí z AFLP fragmentů, která může nalézt taktéž uplatnění v taxonomických studích sinic. Ze získaných a následně osekvenovaných fragmentů mohou být navrženy primery specifické pro určitý rod nebo druh.

Abstract:

Molecular marker is a selected part of DNA, whose composition reflects the relationship among individuals, populations and species. The thesis aim was to compare the possibilities to use of the methods based on molecular markers - AFLP and 16S rRNA in the taxonomy of selected cyanobacterial genera Nodularia and genera of the order Oscillatoriales - Phormidium, Geitlerinema, Microcoleus. A single-cell PCR method was optimised. Method of original sequences based on AFLP fragments was improved. This study compares the benthic species of N. sphaerocarpa with marine and brackish species of N. harveyana and N. moravica. It was found that the species of N. harveyana is clearly differentiated from other selected genera of Nodularia. With respect to the position in phylogenetic tree it is proposed to classify the strain Nodularia sp. (CCAP 1452/6) as N. harveyana. It is also suggested to label the strain N. sphaerocarpa (SAG 50.79) with the respect to the relationship to N. moravica and keep it as Nodularia sp. The analyses of selected strains of the order Oscillatoriales made different conclusions. It was confirmed that genus Phormidium is polyphyletic. The sequences of the 16S rRNA gene concluded the relationship between Ph. autumnale and M. vaginatus. The study of the secondary structure of ITS segment or 11 bp long insert at the sixth loop of 16S rRNA will be better for the subsequent determination of phylogenetic relationships of these strains. In contrast, the data of the AFLP technique assigned to the group Phormidium - Microcoleus the strains of G. carotinosum and G. pseudoacutissimum. It adverts to the heterogenity of the genus Geitlerinema. G. splendidum is only one well-defined species and for further studies it is recommended to compare the species of the genus Geitlerinema with G. splendidum. Single-cell PCR was improved by the repeated freezing the samples in the liquid nitrogen. Then PCR products may be sequenced and used for further phylogenetic studies. This method eliminates the problems with the cultivation of cyanobacteria. It was also found an optimal method for obtaining the original sequence from AFLP fragments, which may find an application in the taxonomy of cyanobacteria as well. It can be designed the primers specific to a particular genus or species based on the sequences of obtained fragments.

Klíčová slova

Sinice, Nodularia, Phormidium, Geitlerinema, Microcoleus, 16S rRNA, PCR, AFLP

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 5. 2011

Zveřejnit od: 6. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 2. 6. 2011
• Vedoucí: Doc. RNDr. Petr Hašler, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie