Detekce podmíněně patogenních mykobakterií v biologických matriálech

Bc. Krystyna Kantorová

Diplomová práce

Detection of potentially pathogenic mycobacteria in biological material

Anotace:

V minulosti bylo určení netuberkulózních mykobakterií jednoduše proveditelné limitovaným panelem biochemických a kultivačních testů. Z důvodu stále se zvyšujícího množství nově popsaných druhů je problematická jak fenotypová identifikace druhu, tak přesné určení geneticky velmi podobných mykobakterií. Zvyšující se incidence netuberkulózních mykobakteriálních infekcí vedla k rozvoji molekulárních metod pro jejich rychlou detekci a identifikaci. Pro identifikaci mykobakterií je standardně používána širokospektrá 16S rRNA PCR s následnou sekvenční analýzou. Avšak tento přístup není vhodný pro rozlišení zástupců skupiny M. marinum (MMS) z důvodu jejich blízké genetické podobnosti. Proto cílem této práce bylo zavést cílenou kultivačně nezávislou metodu detekce M. marinum a aplikovat ji na reálné vzorky. V této práci byly použity dvě kvantitativní real-time PCR (qPCR) reakce: (i) primární erp qPCR s technologií TaqMan sond byla využita ke kvantifikaci MMS ve vzorcích tkání; (ii) následující IS2404 qPCR umožnila odlišit M. marinum od dalších mykobakterií v rámci MMS. Tento rychlý systém detekce M. marinum byl aplikován na klinické vzorky od dvou pacientů. Rovněž byly vyšetřeny na možnou přítomnost a distribuci mykobakterií MMS akvarijní ryby od čtyř pacientů s prokázanou infekcí M. marinum. Na možnou přítomnost M. marinum byly také vyšetřeny sladkovodní ryby České Republiky. Zavedený přístup umožnil kultivačně nezávislé potvrzení infekce M. marinum u obou pacientů zahrnutých do studie. Vyšetření akvarijních ryb odhalilo M. marinum u 13 jedinců pocházejících od tří pacientů s prokázanou infekcí. U dalších 8 ryb těchto pacientů byli prokázáni další zástupci MMS. Vyšetření ryb ze sladkovodních vod ČR neprokázalo přítomnost M. marinum. Množství případů onemocnění lidí způsobených M. marinum se zvyšuje. Většina popsaných případů kožní infekce M. marinum měla souvislost s akvarijním prostředím. Proto je důležité, aby lidé s akutním nebo chronickým poškozením kůže používali při čištění akvárií rukavice a dodržovali zásady hygieny.

Abstract:

Identification of nontuberculous mycobacteria was easily feasible by resorting to a limited panel of biochemical and cultural tests in the past. Rapid increase in the number of recognized mycobacterial species made both the phenotypic identification and differentiation of genetically similar species more problematic. An increasing incidence of nontuberculous mycobacterial infections led to development of rapid and sensitive techniques that can identify mycobacterial species. PCR-based methods were recently used for this purpose. The detection and differentiation of M. marinum group (MMG) by sequence analysis of 16S rRNA gene is questionable due to high sequence similarity within this group. The aim of this study was to introduce cultivation independent method for detection of M. marinum and application of this approach for real samples. In this study, the following real-time quantitative PCR (qPCR) assays were used: (i) a primary erp qPCR, with TaqMan probes, able to quantify MMG in tissue samples; (ii) a secondary IS2404 qPCR for the selective differentiation of M. marinum from other members of MMG. All assays were applied for the fast detection of M. marinum in clinical specimens of two infected humans. Additionally, the possibility to screen for presence and distribution of MMG in ornamental fish collected from the aquaria of four infected humans was tested. Additionally, the screening for M. marinum presence in freshwater fish collected in the Czech Republic was carried out. A cultivation independent diagnostic tool, which was introduced in this study, confirmed the presence of M. marinum infection in both patients. The analysis of ornamental fish revealed the presence of M. marinum in the 13 individuals collected from aquaria of three patients with M. marinum infection. Other members of the MMG were discovered in the 8 fish in this aquarium environment. The samples from freshwater fish were negative to the presence of MMG. There is an increasing incidence of infections caused by M. marinum. Fish-tank exposure is the source of the most cases of cutaneous M. marinum infections and may be prevented by the use of waterproof gloves by person with acute or chronic open skin lesions. Also hygienic behavior plays the role in the spread of M. marinum infection.

Klíčová slova

Mycobacterium marinum, netuberkulózní mykobakterie, molekulární detekce, kvantitativní real-time PCR

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 6. 2011
• Vedoucí: RNDr. Michal Slaný, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Obecná biologie