Vztah struktury a funkce proteinových komplexů při zajištění stability genomu

Mgr. Pavel Veverka, Ph.D.

Doctoral thesis

Structure - function relationships of protein complexes in the genome stability maintenance

Abstract:

V rámci této práce jsou shrnuty výsledky týkající se proteinů shelterinu specificky vázajícího a chránícího lidské telomery a také nervového transkripčního faktoru REST. Během našich studií se nám podařilo určit strukturní obálku proteinu REST pomocí elektronové mikroskopie a stanovit vazebnou afinitu k rozpoznávané kanonické DNA. Naše výsledné protokoly přípravy proteinu REST mohou být použity pro následné studie za účelem podrobné strukturní a funkční analýzy transkripčního faktoru REST, který je kritický pro vývoj a diferenciaci nervových buněk. Náš výzkum proteinů shelterinu objasňuje způsob sestavení jádra shelterinového komplexu pomocí měření na úrovni jednotlivých molekul. Zjistili jsme, že TRF1 způsobuje disociaci TRF2 v jeho vazebném místě na proteinu TIN2 bez přítomnosti TPP1. Až teprve přidání TPP1 umožňuje současnou vazbu obou proteinů TRF1 a TRF2 na TIN2. Navrhli jsme model vazby postupného skládání komponent jádra shelterinového komplexu. V rámci dalších studií jsme stanovili disociační konstanty pro binární vazby proteinů shelterinu a telomerové DNA. Kvantitativní analýza interakcí v kombinaci s dalšími experimenty ukazují protein TPP1 jako kritické místo celého shelterinu, na které by bylo možné cílit za účelem narušení udržovaní délky telomer u nádorových buněk.

Abstract:

This work summarizes the current knowledge and recent findings regarding shelterin proteins that specifically bind and protect human telomeres, as well as the neural transcription factor REST. In our studies, we determined the structural envelope of the REST protein by electron microscopy and the binding affinity of REST to the recognized canonical DNA. Our results regarding REST preparation protocols can be used for subsequent studies focused on detailed structural and functional analyses of the REST transcription factor, which is critical for neuronal cell development and differentiation. Our research on shelterin proteins elucidates how the core shelterin complex is assembled through single-molecule level experiments. We found that TRF1 causes the dissociation of TRF2 at the binding site on TIN2 in the absence of TPP1. Only the addition of TPP1 allows for the simultaneous binding of both TRF1 and TRF2 proteins to TIN2. We proposed a model for the sequential assembly of the core components of the shelterin complex. In the following studies, we determined the dissociation constants of the binary interaction between shelterin proteins and telomeric DNA. Quantitative analysis of the interactions, combined with other experiments, indicated TPP1 protein as a critical site of the entire shelterin complex that could be targeted to suppress telomere length maintenance in cancer cells.

Keywords

Telomery, telomeráza, shelterin, DNA, protein, TRF2, REST, REST-N62, protein-proteinové interakce, elektronová mikroskopie, telomeres, telomerase, protein-protein interaction, electron microscopy

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 1. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 30. 1. 2023
• Supervisor: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.
• Reader: Mgr. Veronika Altmannová, Ph.D., Mgr. Soňa Legartová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics