Využití cytometrické analýzy kvality spermií pro optimalizaci metod asistované reprodukce

Bc. Nella Tarantová

Diplomová práce

Optimization of methods used for separation of sperm for assisted reproduction

Anotace:

Jedním z problémů současné společnosti je bezesporu téma stále se zvyšující neplodnosti mužů. Tlak vyvíjený na laboratoře center asistované reprodukce je tak obrovský, protože je velmi důležité maximálně optimalizovat současné postupy a testovat nové metody separace kvalitních spermií s cílem zvýšit úspěšnost cyklů.K diagnostice kvality ejakulátu se využívá nejen spermiogram, ale také cytometrické stanovení procenta živých a apoptotických spermií nebo stanovení spermií s fragmentací DNA. Selekce spermií z ejakulátu se provádí tradičně gradientovou centrifugací (GC) nebo swim-up (SU). Testují se ale i nové metody jako magnetická separace spermií (MACS) nebo separace pomocí mikrofluidního systému (MFSS).Diplomová práce je rozdělena na experimentální a klinickou část. Cílem experimentální části bylo pomocí průtokové cytometrie ověřit účinnost odstranění apoptotických spermií v ejakulátu u vybraných separačních metod. Byla stanovena hypotéza, že rutinní GC není vhodná pro vzorky s nízkým zastoupením živých spermií v ejakulátu.Statisticky významný pokles procenta živých spermií po GC separaci byl zjištěn u vzorků, které měly nízké zastoupení živých spermií v ejakulátu (< 50 %). Tímto bylo prokázáno, že pro tyto pacieny není GC vhodná metoda. Experimentálně byly u podobných typů ejakulátů ověřeny alternativní metody separace (SU, MFSS, MACS). Za nejvýznamnější výsledek byl považován signifikantní vzestup procenta živých spermií po MFSS. Metoda MFSS byla proto doporučena pro rutinní využívání u pacientů s vysokým zastoupením apoptotických spermií nebo vysokou fragmentací DNA.Cílem klinické části bylo ověřit, zda stanovení procenta živých a apoptotických spermií v ejakulátu může předpovědět kvalitu embryí. Předpokladem bylo, že vysoké zastoupení apoptotických spermií bude mít negativní vliv na úspěšnost cyklu.Obdobně jako v jiných publikacích, tak ani v této práci se tato hypotéza neprokázala. Z výsledků vyplývá, že u skupiny s nízkým procentem apoptotických spermií (ApoLow) byl signifikantně vyšší parametr FR (fertilizaton rate), avšak ostatní parametry úspěšnosti cyklu byly vyšší u skupiny s vysokým procentem apoptotických spermií (ApoHigh). Možným důvodem byl vyšší počet transferů nejkvalitnějších blastocyst (BL5) u skupiny ApoHigh. Byla totiž prokázána významně vyšší úspěšnost cyklu při transferu BL5.Závěrem lze říci, že cytometrické vyšetření ejakulátu je kvalitní diagnostickou metodou a získané informace mohou přispět k volbě vhodných postupů zpracování ejakulátu před in vitro oplozením.

Abstract:

One of the biggest problems in current society is the increasing amount of men’s inferti- lity. The pressure on laboratories for assisted reproduction technology (ART) is huge. The most important requirements in this field are specifying the diagnosis of infertile men and developing better techniques for more successful ART.Diagnosis methods include the spermiogram, the flow cytometric analysis of the viable and apoptotic sperm, or the analysis of sperm DNA fragmentation. Sperm selected was through density gradient centrifugation (GC), swim-up (SU), or methods such as magnetic sperm separation (MACS) and microfluidic separation (MFSS).This diploma thesis has two parts, experimental and clinical. The aim of the experimental part was to verify the efficiency of sperm separation techniques by analysis of the viable and apoptotic sperm in semen. The hypothesis was that routine density gradient centrifugation is not suitable for samples with low levels of viable sperm in the ejaculate and more gentle separation techniques would be more effective. A decrease in the viable sperm percentage after GC separation was found in samples with low levels of viable sperm in semen (<50 %), which confirmed the first hypothesis.Separation techniques such as GC, SU, MFSS and MACS were also tested using similar quality semen (<50 % viable sperm). The most significant result was the increase in the viable sperm percentage after MFSS. The MFSS technique would be recommended for routine use for patients with high levels of apoptotic sperm or high DNA fragmentation. The aim of the clinical part was to verify whether the analysis of the viable and apoptotic sperm in the ejaculate can predict lower embryo quality. The hypothesis was that a high level of apoptotic sperm has a negative impact on the success of ART.The outcome was that FR (fertilization rate) was much higher in the low apoptotic sperm percentage group (ApoLow), but other parameters of ART efficiency were higher in the high apoptotic sperm percentage group (ApoHigh). The hypothesis was not confirmed like in similar studies. It was likely due to more embryo transfers of the highest quality blastocysts (BL5) in the ApoHigh group compared to ApoLow group. The transfer of BL5 was significantly more successful.In summary, the flow cytometric analysis of semen is a quality diagnostic technique and information gained can help with the proper choice of sperm separation technique earlier in vitro fertilization.

Klíčová slova

spermie, asistovaná reprodukce, apoptóza, spermiogram, průtoková cytometrie

Keywords

flow cytometry, sperm, assisted reproduction technology, apoptosis, spermiogram

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Ondřej Šimoník, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie