Identifikace a charakterizace fyzických interakcí vybraných molekul v lidských embryonálních kmenových buňkách

Bc. Barbara Šalingová

Diplomová práce

Identification and characterisation of physical interactions of the selected molecules in human embryonic stem cells

Abstract:

Human embryonic stem cells are cell lineages isolated from human blastocyst, cultivated in vitro conditions. These cells posses unique abilities of self-renewal and pluripotency. Due to these special abilies hES cells have the potencial to become an important tool in regenerative medicine, treatment of neurodegerative diseases or organ transplants. However the practical application of hES cells is limited by our knowledge of their physiology and processes of proliferation and differenciation. Thanks to a great progress in proteomics it is possible nowadays to study cell physiology on the protein level. The option to study protein-protein interactions led us to use this method to adress the question of significance of CDK5 presence in hES cells. CDK5 is a kinase primarily discovered in neurons. While CDK5 is expressed ubiquitinously in mamalian tissues, its activator proteins are predominalntly expressed in neurons, and, thus its activity was mainly associated with central nervous system. It regulates most important processes responsible for neurodiferenciation as well as synaptic plasticity (Dhavan and Tsai, 2001). CDK5 was also shown to be one of the major regulatory proteins involved in the pathology of neurodegenerative diseases (Shelton and Johnson, 2004). Later CDK5 was discovered to be present in various other cell types, where it is responsible for regulation of insulin secretion, myogenesis and lens developement. In spite of the great progress in thi research some of the functions of CDK5 remain still elucid (Rosales and Lee, 2006; Lilja et al.,2004; Sahlgren et al., 2003; Negash et al., 2002). CDK5 was recently discovered in hES and mES cells (Hampl, unpublished data). The aim of this study was to confirm this finding and assess the quantity of CDK5 present in hES cells. It was also our intention to identify interaction partners of CDK5 with the use of Mass Spectrometry. In my work I was able to confirm the presence of CDK5 in hES cells. Its quantity in hES cells was not significantly different from the quantities in various other cell types. I was also able to optimise precipitation for Mass Spectrometry analysis and identify three interaction partners of CDK5. These results must still be verified by different methods for studing protein interactions.

Abstract:

Ľudské embryonálne kmeňové bunky sú bunkové línie izolované z embrya v štádiu blastocysty, kultivované v in vitro podmienkach. Tieto bunky sa vyznačujú charakteristickými vlastnosťami pluripotencie a sebaobnovy. Práve vďaka týmto vlastnostiam skrývajú potenciál pre praktické využitie v mnohých odtvetviach medicíny. V súčasnosti je však ich aplikácia limitovaná nedostatočným poznaním procesov, ktoré riadia ich množenie, diferenciáciu ako aj celkovú fyziológiu. Práve s rozvojom proteomiky je možné v súčasnosti komplexne skúmať väzby medzi jednotlivými proteínmi v bunke a umožňuje opísanie zložitých fyziologických procesov na úrovni proteínov. CDK5 je kinázou, ktorá bola objavená v neurónoch, kde boli opísané mnohé z jej funkcií hlavne v súvislosti s reguláciou procesov súvisiach s patológiu neurodegeneratívnych ochorení (Dhavan a Tsai, 2001; Shelton a Johnson, 2004). Neskôr bola prítomnosť CDK5 dokázaná v rôznych tkanivách organizmu, kde sa podieľa na regulácii procesov sekrécie, myogenézy a vývoja šošovky. Mnohé z jej funkcií aj napriek intenzívnemu výskumu sú dodnes neznáme (Rosales a Lee, 2006; Lilja et al.,2004; Sahlgren et al., 2003; Negash et al., 2002). Iba nedávno bola objavená CDK5 v hES ako aj mES bunkách (Hampl, nepublikované výsledky). Zámerom tejto práce bolo potvrdiť tento nález a kvantifikovať množstvo CDK5 v hES bunkách. Neskôr pomocou hmotnostnej spektrometrie identifikovať potenciálnych interakčných partnerov CDK5. Bola potvrdená prítomnosť CDK5 v hES bunkách, jej množstvo sa prekvapivo nelíšilo od množstva CDK5 v neuronálnych prekurzoroch alebo bunkách fetálneho mozgu. Po optimalizácii hmotnostnej analýzy sme boli schopní identifikovať troch interakčných partnerov CDK5 - Tranzičná endoplazmatická ATPáza, Podjednotka gama sodného kanálu a TUBB proteín. Tieto výsledky je však nevyhnutné potvrdiť použitím aj iných metód.

Klíčová slova

cyklín-dependentná kináza 5, ľudské embryonálne kmeňové bunky, hmotnostná spektrometria, proteomika cyclin-dependent kinase 5, human embryonic stem cells, Mass Spectrometry

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 6. 2011
• Vedoucí: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika