Použití síru obsahujících peptidů a proteinů jako biologické části biosenzoru pro analýzu těžkých kovů

Bc. Vojtěch Adam, Ph.D.

Diplomová práce

Anotace:

Znečištění životního prostředí toxickými těžkými kovy je výsledkem mnoho lidských aktivit jako je těžký těžební a hutní průmysl. Následný vliv těchto kovů na ekosystémy má obrovský význam nejen z hlediska významu pro lidské zdraví, ale také z hlediska ekonomického, protože tyto prvky a nejsou biodegradovatelné a jsou akumulovány v různých živých systémech. Kromě "standardních" toxických kovů jako je kadmium, olovo a rtuť, jejichž koncentrace v životním prostředí je monitorována po mnoho let, se v poslední době zaměřuje pozornost na platinové kovy (platinu a rhodium) z důvodu zavedení katalyzátorů. A navíc platinové komplexy hrají velmi významnou roli v chemoterapii různých druhů nádorových onemocnění. Jako následek vzrůstajícího používání platiny jak v průmyslu, tak pro zdravotnické účely, je nezbytné vyvíjet techniky nejen pro stanovení "standardních" kovů, ale také platinových sloučenin a monitorovat tak jejich hladinu v různých složkách životního prostředí a živých systémech. Vývoj různých biosensorů pro tyto účely a jejich použití namísto robustních analytických technik má obrovský potenciál z důvodu výhod, které využití biosenorů poskytuje jako např. specifita, nízké náklady, jednoduché použití a možnost monitoringu v reálném čase. Cílem této práce bylo navrhnout biosensory pro stanovení těžkých kovů založené na interakci těžké kovy vázajících látek (fytochelatin PC2 a metalothionein MT) pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí (AdTS) diferenční pulsní voltametrie (DPV). Nejprve jsme využili PC2 biosensor pro stanovení kademnatých a zinečnatých iontů, a cisplatiny. Limity kvantifikace byly pro Cd(II) 0.6 pmolu, Zn(II) 8 pmolu a pro cisplatinu 1 pmolu v 5 ul kapce vzorku. Poté, co jsme prokázali, že jsme schopni navrhnout biosensor prostřednictvím modifikace visící rtuťové kapkové elektrody, jsme se pokusili využít protein metalothionein namísto PC2 pro stejné účely. Nejprve jsme studovali elektrochemické chování MT na povrchu visící rtuťové kapkové elektrody pomocí AdTS DPV. Dokonalého pokrytí povrchu elektrody bylo pravděpodobně dosaženo po 240 s při adsorpci 10 uM MT. Dosažené limity kvantifikace analyzovaných těžkých kovů (kadmia(II) a zinku(II)) v přítomnosti základního elektrolytu (0.5 M NaCl, pH 6.4) byly 160 fmolů Cd(II) a 220 fmolů Zn(II) v 5 ul kapce vzorku. Dále jsme aplikovali MT biosensor na analýzu těžkých kovů v lidských tělních tekutinách (lidská moč a krevní sérum) a porovnali s metodou DPASV. MT biosensor byl na závěr použit pro studium interakcí mezi cisplatinou a dsDNA a pro kvantifikaci Pt(II)-DNA aduktů.

Abstract:

The pollution of the environment with toxic metals is a result of many human activities, such as mining and metallurgy, and the effects of these metals on the ecosystems are of large economic and public-health significance, because these substances are not biodegradable and retained by the ecological system. Besides "standard" toxic metals such as cadmium, lead and mercury, which have been monitoring for many years, following the introduction of automobile catalytic converters the platinum group metals (platinum and rhodium) gain on increasing interest in environmental research. Moreover platinum complexes play an important role in the chemotherapy of various tumour diseases. As a consequence of the increasing employment of platinum for exhaust purification, in industry and tumour diseases treatment, it became necessary to determine not only "standard" toxic metals but also platinum compounds in a wide range of biological and environmental matrices. Suggestion of biosensors could be very suitable for these purposes instead of robust analytical techniques, because biosensors have the advantages of specificity, low cost, ease of use, portability and the ability to furnish continuous real time signals. The aim of this work was to suggest new heavy metal biosensors based on interaction of metals (cadmium and zinc) with heavy metal binding biological compounds (phytochelatin PC2 and/or metallothionein MT), using adsorptive transfer stripping (AdTS) differential pulse voltammetry (DPV). Primarily, we utilized PC2 biosensor to determine cadmium, zinc and cisplatin. The quantification limits (3 S/N) of Cd(II), Zn(II) and cisplatin were about 0.6, 8 and 1 pmole in 5 ul, respectively. After that we did proved that we were able to suggest biosensor through modification of hanging mercury drop electrode, we attempted to utilize metallothionein instead of PC2 for the same purposes. We studied the electrochemical behaviour of MT on the surface of hanging mercury drop electrode by AdTS DPV. Perfect coverage of the electrode surface (forming of the surface assembled monolayer) was probably reached at time about 240 s for 10 uM protein concentration. The quantification limits of the analysed heavy metals (cadmium(II) and zinc(II)), which were analysed in the presence of 0.5 M NaCl (pH 6.4), were 160 and 220 fmole in 5 ul drop, respectively. In addition, we applied the MT biosensor to analyse heavy metals in human body liquids (human blood serum and human urine) and to compare with differential pulse anodic stripping voltammetry. Moreover, we used MT biosensor to investigate interactions between cisplatin and dsDNA and to quantify the Pt(II)-DNA adducts.

Klíčová slova

Biosensor, metallothioenin, phytochelatin, heavy metals, cadmium, zinc, cisplatin, DNA, PT(II)-DNA adducts, electrochemistry, adsorptive transfer stripping technique, differential pulse voltammetry.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 5. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2006
• Vedoucí: prof. RNDr. Přemysl Lubal, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Chemie / Analytická chemie