Příprava a analýza tRNA pomocí nukleární magnetické rezonance

Bc. Hana Uhlíková, Ph.D.

Diplomová práce

Characterization of tRNA by nuclear magnetic resonance spectroscopy

Anotace:

DNA-závislá RNA polymerasa (RNAP) je enzym katalyzující syntézu RNA, na templátu DNA. RNA polymerasa, která je obsažena ve všech buňkách, je zodpovědná za polymeraci nukleosidtrifosfátů ATP, CTP, GTP a UTP v reakci poháněné uvolněním a následnou hydrolýzou PPi. U bakterií jeden enzym zabezpečuje syntézu všech typů RNA v buňce, naproti tomu eukaryotní buňky obsahují čtyři až pět druhů RNA polymeras. V této práci se úspěšně podařilo implementovat techniku in vitro transkripce pomocí T7 RNA polymerasy z bakteriofágu, která mimo jiné obsahovala i expresi a purifikaci rekombinantní T7 RNA polymerasy. Vyprodukované tRNA byly použity pro předběžnou NMR analýzu pomocí 1H NMR spektra. V poslední části projektu byly přepsány fragmenty snRNA, které budou následně použity při studiu mechanismu transkripční terminace.

Abstract:

DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) catalyzes synthesis of RNA on a DNA template. All cells contain RNA polymerase which catalyzes polymerization of nucleoside triphosphates ATP CTP, GTP and UTP in a reaction driven by release and hydrolysis of PPi. In bacteria only one enzyme is responsible for synthesis of all cell´s RNAs. Eukaryotic cells on the other hand contain four respectively five different RNAPs. In this thesis the technique of in vitro transcription was successfully implemented by using a bacteriophage T7 RNA polymerase which also included expression and purification of the recombinant T7 RNA polymerase. Transcribed tRNAs were used for preliminary NMR analysis using 1H spectra. The last part of the project was an in vitro transcription of fragments of snRNAs which will be further used for studying transcription termination mechanism.

Klíčová slova

štěpení palzmidů, tRNA, T7 RNA polymerasa, struktura RNA, transkripce in vitro, HPLC, butanolová extrakce, 1H NMR

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2010
• Vedoucí: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie