Epiteliální imunita hmyzu

Barbora PISKLÁKOVÁ

Bachelor's thesis

Insect epithelial immunity

Abstract:

Abstrakt Vrstva epiteliálních buněk odděluje rozhraní mezi vnitřním a vnějším prostředím hmyzu. Střevní epitel hmyzu hraje důležitou roli v mnoha procesech, které zahrnují výživu, imunitní reakce a osmoregulaci. V teoretické části této práce jsou zpracovány dostupné poznatky o složkách a funkci epiteliální imunity hmyzu se zaměřením na roli reaktivních forem kyslíku, oxidu dusnatého a antimikrobiálních peptidů, jakožto hlavních signálních a efektorových molekul. V praktické části byly včelám extrahovány trávicí soustavy, které byly inkubovány s lipopolysacharidem a odebírány v různých časových intervalech. V extraktech těchto trávicích soustav byla následně stanovována specifická aktivita katalasy a superoxiddismutasy a koncentrace NO2-, jakožto jediného stabilního konečného produktu autooxidace NO ve vodném roztoku v nepřítomnosti hemoproteinů. Dále byla provedena mikroskopická detekce peroxidu vodíku, superoxidového anionradikálu a oxidu dusnatého bez inkubace a s inkubací s lipopolysacharidem. Peroxidu vodíku byl detekován pomocí 0,5% roztoku diaminobenzidinu, superoxidový anionradikál pomocí 2mM roztoku tetrazoliové modři a oxid dusnatý pomocí fluorescenční sondy DAF-FM diacetát. Byla provedena také tricinová elektroforéza extraktů vzorků trávicích soustav a imunochemická detekce antimikrobiálních peptidů defensinu a abaecinu po přenosu proteinů a peptidů na nitrocelulosovou membránu. Specifická aktivita katalasy se při inkubaci s lipopolysacharidem v čase zvyšovala, nejvyšší byla po 18 hodinách. Specifická aktivita superoxiddismutasy vykazovala nejvyšší hodnoty po 8 hodinách inkubace s LPS. Nejvyšší koncentrace NO2- byla naměřena po 2 hodinách inkubace s LPS a postupně se snižovala. Mikroskopickou detekcí bylo potvrzeno, že při styku s bakteriemi nebo jejími složkami dochází ke zvýšené produkci H2O2, O2-- a NO. Pro vizualizaci proteinů na gelech se lépe osvědčil kit One-step Lumitein Protein Gel Stain. Imunochemická detekce defensinu a abaecinu nebyla úspěšná, pravděpodobně vzhledem k jejich nízké koncentraci v epiteliálních buňkách.

Abstract:

Abstract A layer of epithelial cells defines every interface between the inner world of the insect body and the outer world of the external environment. The insect gut epithelium plays an important role in multiple processes, including nutrition, immunity and osmoregulation. The theoretical part of this Bachelor's thesis describes available knowledge about components and functions of insect epithelial immunity focusing on the role of reactive oxygen species, nitric oxide and antimicrobial peptides as main signal and effector molecules. In the practical part of the Bachelor's thesis honey bee digesticve tracts were removed and incubated with lipopolysachyride for different time intervals. In extracts of these digestive tracts catalase and superoxid dismutase specific activities, as well as NO2- concentration were determined. Nitrite is the main stable endproduct of the autoxidation of NO in aqueous solution in the absence of hemoproteins. The microscopic detection of hydrogen peroxide, superoxide anion radical and nitric oxide was performed without and with incubation with lipopolysacharide. Hydrogen peroxide was detected using 0,5% solution of diaminobenzidine, superoxide anion radical was detected using 2mM solution of nitro blue tetrazolium chloride and nitric oxide was detected using DAF-FM diacetate fluorescence probe. Tricine electrophoresis of digestive tract extracts and immunochemical detection of defensin and abaecin antimicrobial peptides after protein and peptide transfer to the nitrocellulose membrane were also tested. Catalase specific activity increased after incubation with lipopolysaccharide over time, the highest activity was observed after 18 hours. Specific activity of superoxide dismutase showed the highest values after 8 hours of incubation with LPS. The highest nitrite concentration was measured after 2 hours of incubation with LPS and gradually decreased. Microscopic detection confirmed that contact with bacteria or its components results in increased production of H2O2, O2-- and NO. The One-step Lumitein Protein Gel Stain kit was proven better for visualizing proteins on electrophoretic gels. Immunochemical detection of defensin and abacine was not successfu, probably due to their low concentration in epithelial cells.

Keywords

Hmyz, imunita, oxid dusnatý, reaktivní formy kyslíku, antimikrobiální peptidy, včela medonosná

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2018

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry