Dynamika membrán, cytoskeletu a reaktivních forem kyslíku při polárním růstu rostlinných buněk

Mgr. Lenka KUBĚNOVÁ

Doctoral thesis

Dynamic properties of membranes, cytoskeleton and reactive oxygen species during polar growth of plant cells

Abstract:

Kořenové vlásky a jejich apikální růst slouží jako excelentní model pro studium polárního prodlužování buněk. Díky nim je rostlina stabilněji ukotvena v půdě, zvětšují povrch kořenového systému, což vede k efektivnějšímu příjmu vody a živin, a v neposlední řadě se podílejí na interakci s mikroby. Iniciace a následný polární růst kořenových vlásků je velice složitý proces, který zahrnuje mnoho navzájem propojených mechanismů. Mezi nezbytné děje nutné k založení a udržení polárního růstu kořenových vlásků patří polarizace cytoskeletu, vezikulární transport a lokalizované ukládání buněčné stěny v místě trichoblastu, ze kterého budoucí kořenových vlásek vyrůstá. Současný stav poznání, zabývající se právě procesy vývoje kořenových vlásků a jejich polárního růstu, je shrnutý v teoretické části této disertační práce. Hlavním cílem praktické části byla důkladná charakteristika dvou rozdílných mutantů (der1-3 a rhd2-1) rostlin Arabidopsis thaliana, kteří mají poruchu růstu kořenových vlásků. Mutant der1-3 ("defective root hairs 1") má bodovou mutaci v ACTIN2 genu. ACTIN2 je nejvíce se vyskytují isovarianta aktinu ze skupiny isovariant vegetativního aktinu. ACTIN2 je zároveň nezbytnou součástí mechanismu růstu kořenových vlásků. Identifikace der1-3 mutanta byla proto založená na vyhledávání fenotypu krátkých kořenových vlásků. Pomocí důkladného fenotypování rostlin, studia pletiv kořenového systému a analýz na subcelulární úrovni jsme zjistili, že mutace v ACT2 genu má výraznější efekt na celkový vývoj a růst rostlin, což v předchozích studiích tohoto mutanta popsáno nebylo. Dále pak, díky lepším růstovým parametrům, zvýšené dynamiky aktinového cytoskeletu a účinnější biochemické ochrany der1-3 mutanta po působení oxidativního stresu bylo zjištěno, že je více odolný na tento typ stresu oproti kontrolním rostlinám. Získané výsledky podpořili fakt, že aktinový cytoskelet nehraje roli jen při růstu a vývoji rostlin a kořenových vlásků, ale že ovlivňuje i reakci rostlin na oxidativní stres. To vše dohromady by mohlo mít slibný potenciál v budoucím zemědělském a biotechnologickém využití. V apikální části plazmatické membrány (PM) rostoucích kořenových vlásků A. thaliana se nachází NADPH oxidasa typu C, pojmenována jako "respiratory burst oxidase homolog protein C/ROOT HAIR-DEFECTIVE 2" (AtRBOHC/RHD2). Tato oxidasa tvoří reaktivní formy kyslíku (ROS), které mimo jiné udržují polární růst kořenových vlásků. Bodová mutace v RHD2 genu způsobuje fenotyp krátkých kořenových vlásků, čímž je rhd2-1 ("root hair defective 2") mutant charakteristický. V této části jsme detailně popsali časoprostorovou distribuci a dynamické vlastnosti transportu AtRBOHC/RHD2 proteinu do plazmatické membrány rostoucích kořenových vlásků. S využitím různých pokročilých mikroskopických metod a pomocí následných kvantitativních mikroskopických analýz, trasovaní jednotlivých kompartmentů a pomocí subcelulárních kolokalizací jsme popsali komplexní mechanismus transportu a recyklace AtRBOHC/RHD2 v rámci apikální PM během tvorby a následného apikálního růstu kořenového vlásku u Arabidopsis. Nová data, prezentovaná v této disertační práci, byla získána s využitím pokročilých mikroskopických metod pro rychlé snímání dynamických procesů (konfokální mikroskopie s rotujícím diskem), dlouhodobé vývojové snímání za podmínek, blížících se těm environmentálním ("light-sheet" fluorescenční mikroskopie) a pro snímání s vysokým rozlišením (konfokální laserová skenovací mikroskopie s Airyscan detektorem). Kombinace nižší míry fototoxicity, většího rozlišení a vyšší rychlosti snímání v průběhu delšího časo

Abstract:

Root hair (RH) tip growth represents an excellent model of polar apical cell expansion in plants. RHs play important functions in anchoring plants in soil, increasing root absorption surface for water a nutrient uptake, and interactions with microbes. The process of RH initiation and RH tip growth maintenance is a complex process. It requires polarization of the cytoskeleton, membrane trafficking, and localized cell wall deposition at the RH initiation side of the trichoblasts. The current knowledge linked to the process of RH formation and tip growth is summarized in the theoretical part of the thesis. The main topic of the thesis was thorough characterization of two different Arabidopsis thaliana mutants (der1-3 and rhd2-1), that are defective in RH tip growth. The mutant der1-3 (deformed root hairs 1) possess a single-point mutation in the ACTIN2 gene. Product of this gene, ACTIN2, is the most abundant vegetative actin isovariant, and is required for RH tip growth. Based on this fact, der1-3 mutant was identified according to its RH phenotype. Our thorough plant phenotyping, tissue patterning, and subcellular localization analyses revealed that this mutation in the ACT2 gene has deeper effects on plant growth and development, which has not known before. Moreover, we found that der1-3 mutant is more resistant to mild and severe oxidative stress. This was demonstrated by better growth parameters, enhanced preservation of actin dynamics, and more effective biochemical protection of the mutant in stress conditions. These data supported better understanding of the actin cytoskeleton roles not only in plant growth and development, but also in plant reactions to oxidative stress, which is promising for potential future agricultural and biotechnological applications. NADPH oxidase type C in A.thaliana, annotated as respiratory burst oxidase homolog protein C/ROOT HAIR-DEFECTIVE 2 (AtRBOHC/RHD2), is localized at the apical plasma membrane (PM) of growing RHs where generates reactive oxygen species (ROS), indispensable for the maintenance of the RH tip growth. Single point mutation in RBOHC/RHD2 gene generates mutant rhd2 (root hair defective 2) with RH phenotype. We characterised in detail the spatiotemporal pattern and mechanism of the AtRBOHC/RHD2 subcellular delivery to the PM during RH formation. Quantitative microscopy, single particle tracking, and subcellular colocalization analyses using different advanced microscopic methods demonstrated the complex nature of AtRBOHC/RHD2 delivery, maintenance, and recycling at the apical PM during RH formation in Arabidopsis. Novel data presented in the thesis were received by utilization of advanced microscopy methods for fast image acquisition (spinning disk confocal microscopy), near environmental developmental imaging (light-sheet fluorescence microscopy), and super-resolution (Airyscan confocal laser scanning microscopy). Combining lower value of phototoxicity, enhanced resolution, and faster imaging speed with longer observation allowed study of living plants in almost natural conditions, bringing physiologically relevant results.

Abstract:

vého úseku umožnila studium živých rostlin v téměř přirozených podmínkách, přinášející fyziologicky relevantní výsledky.

Keywords

A. thaliana, abiotický stres, ACTIN2, cytoskelet, konfokální mikroskopie s Airyscan detektorem, kořenové vlásky, "ligh-sheet" mikroskopie, mikroskopie s rotujícím diskem, NADPH oxidasa (RHD2), polární růst, pozorování živých buněk, steroly, vesikulární transport, vývoj kořene

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 10. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Miroslav Ovečka, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry