Produkce rekombinantních proteinů pro veterinární použití

Mgr. Carlos DÍAZ

Doctoral thesis

Production of recombinant proteins for veterinary use.

Abstract:

ASFV is the deadliest member of the DNA viruses infecting pigs and a massive disaster for pigs caused by the African swine fever virus (ASFV) needs to be stopped. Many researchers have been trying to develop new potential vaccines throughout the years, but there has been no success in preparing a successful vaccine that could protect pigs against the virulent virus for a prolonged time. This work focuses on the design and immunogenicity testing of potential subunit vaccine candidates consisting of ASFV viral proteins CD2v, p22, and heat-labile B subunit of enterotoxin (LTB). Four gene constructs (CD2vCt, LTB-CD2vCt, p22Ct, LTB-p22Ct) were designed. Only the gene parts coding for the outer globular domains of viral proteins, CD2v and p22, alone or fused with a gene coding for LTB, were selected. The LTB's main function is to induce the host immune response. All constructs were used for the expression using bacterial expression strain BL21 STAR and Rosetta 2 strain. Recombinant proteins p22Ct and LTB-p22Ct were successfully overproduced in BL21 STAR cells. The ability to react with different ASFV positive sera confirmed by immunoanalysis indicated the right protein conformation. Recombinant proteins were further used for mice immunisation to analyse their safety and immunogenicity. The protein fused with LTB did not show expected adjuvant properties and did not prove safe since an abscess formation was observed after mice immunisation. On the other hand, immunisation with p22Ct protein alone showed higher antibody titre and conferred safety in mice. These results show the high potential of the p22 antigen as an immunogenic protein, either used for future ASFV vaccine development or detection purposes. Furthermore, this work shows the potential of a novel method, called linear array epitope (LAE), in producing epitope antigens for detection or vaccine purposes.

Abstract:

Virus afrického moru prasat (ASFV z anglického African swine fever virus) je nejsmrtelnějším členem DNA virů infikujících prasata, a proto masivní epidemie způsobená ASFV musí být zastavena. Mnoho vědců v průběhu let pracovalo na vývoji potenciální vakcíny, ale úspěšnou vakcínu, která by dokázala chránit prasata před virulentním virem po delší dobu se zatím nepodařilo připravit. Tato práce se zaměřuje na přípravu a testování imunogenicity potenciálních kandidátů na podjednotkovou vakcínu sestávajících z virových proteinů CD2v, p22 a termálně labilní B podjednotky enterotoxinu (LTB). Byly navrženy čtyři genové konstrukty (CD2vCt, LTB-CD2vCt, p22Ct, LTB-p22Ct). Pro jejich konstrukci byly vybrány pouze části genů kódující vnější globulární domény virových proteinů, CD2v a p22, samostatně nebo sloučené s genem kódujícím LTB. Hlavní funkcí LTB bylo nabudit imunitní odpověď hostitele. Všechny konstrukty byly použity pro expresi pomocí bakteriálního expresního kmene BL21 STAR a kmene Rosetta 2. Rekombinantní proteiny p22Ct a LTB-p22Ct byly úspěšně nadprodukovány v buňkách BL21 STAR. Imunoanalýzou pak byla potvrzena jejich schopnost reagovat s různými séry od prasat infikovaných ASFV, což indikovalo správnou konformaci proteinu. Rekombinantní proteiny byly dále použity pro imunizaci myší pro další analýzu. Fúzní protein LTB-p22Ct nevykazoval očekávané adjuvantní vlastnosti a neukázal se jako bezpečný, protože po imunizaci myší byla pozorována tvorba abscesu. Na druhé straně, imunizace samotným proteinem p22Ct ukázala vyšší titr protilátek a nezpůsobila u myší žádné nežádoucí projevy. Tyto výsledky ukazují vysoký potenciál antigenu p22 jako imunogenního proteinu, který je možné použít buď pro budoucí vývoj vakcín proti ASFV, nebo pro účely jeho specifické detekce. Tato práce také ukazuje potenciál nové metody, nazývané lineární epitopové pole (LAE z anglického linear epitope array), při přípravě epitopových antigenů pro detekční nebo vakcinační účely.

Keywords

Africký mor prasat, tepelně-citlivá enterotoxinová B podjednotka, imunitní odpověď, p22 protein, CD2v protein

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 10. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry