Mutageneze nekódujících RNA u multiformního glioblastomu pomocí metody CRISPR/Cas9

Bc. Matej Jasík

Diplomová práce

Mutagenesis of non-coding RNAs in glioblastoma multiforme by CRISPR/Cas9

Anotace:

Multiformní glioblastom (GBM) je nejagresivnější primární mozkový nádor s mediánem přežití 14,6 měsíce. I přes extenzivní výzkum v této oblasti zůstává GBM nevyléčitelným nádorovým onemocněním. Většina lidského genomu je aktivně přepisována, ale pouze méně než 2 % transkriptů je překládáno do výsledné formy proteinů. Deregulace nekódujících RNA je běžným znakem lidských nádorů. Expresní profily dlouhých nekódujících RNA (lncRNAs) jsou v porovnání s mRNA specifičtější co se týká typu a stavu buňky, tkáně, vývojového stádia nebo stádia nemoci, což naznačuje, že mohou mít důležitou regulační funkci. CRISPR/Cas9 technologie je populárním nástrojem genového inženýrství. Využívá RNA naváděnou endonukleázu Cas9 k interferenci s cílovým lokusem na bázi sekvenční komplementarity. V této práci je zkoumán vztah mezi pseudogenem kódujícím lncRNA butyrophilin subfamily 2 member A3 (BTN2A3P) a patogenezí GBM. Exprese BTN2A3P lncRNA je v nádorové tkáni zvýšená v porovnání se zdravou mozkovou tkání, což nám umožňuje zkoumat její funkci pomocí CRISPR/Cas9 technologie. Prostřednictvím páru vedoucích RNA (gRNAs) cílených do odlehlých častí genu byly vytvořeny tři linie s knockoutovaným genem BTN2A3P, které se lišily typem mutace. Takto připravené linie byly charakterizovány pomocí dostupných in vitro assayí. Všechny tři linie proliferovaly a uzavíraly mezeru pomaleji ve srovnaní s kontrolní wild type linií, také klonogenní assay odhalila odlišnou morfologii kolonií u knockoutovaných linií. Výsledky prezentované v této práci přispěly k objasnění role BTN2A3P lncRNA u GBM.

Abstract:

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive primary brain tumour with a median survival of 14.6 months. Despite extensive research, GBM remains incurable. Majority of human genome is actively transcribed, but only less than 2 % of transcripts codes for proteins. Dysregulation of non-coding RNAs is common event in human tumours. Expression patterns of long non-coding RNAs (lncRNAs) in humans were shown to be more specific regarding cell type, cell state, tissue, developmental stage, or disease status than those of mRNAs. This finding hints at their important regulatory function. CRISPR/Cas9 technology is popular tool for genetic engineering. It utilizes RNA guided endonuclease Cas9 to interfere with target locus in a sequence specific manner. In this thesis, we explore relationship of butyrophilin subfamily 2 member A3, pseudogene (BTN2A3P) lncRNA to GBM pathogenesis. This lncRNA was shown to be upregulated in glioblastoma tissue compared to non-tumour tissue, allowing us to study its role by loss-of-function experiment. To this end, CRISPR/Cas9 technology was employed. Using paired guide RNAs to target remote parts of BTN2A3P gene, three knockout lines with different mutations were generated. Prepared knockout lines were characterized by available in vitro assays. All three lines exhibited slower proliferation and wound closing rate compared to control wild type line. These lines also displayed distinct colony morphology in colony formation assay. Results presented in this thesis contributed to uncovering role of BTN2A3P lncRNA in GBM.

Keywords

CRISPR/Cas9, LncRNA, Glioblastoma multiforme, Tumour, Mutagenesis, U-251 MG Multiformní glioblastom, Nádor, Mutageneze

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 6. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 7. 2020
• Vedoucí: RNDr. Kamila Součková, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Molekulární biologie a genetika