Molekulární a funkční analýza biologie kasein kinázy 1

Mgr. Tomáš Gybeľ, Ph.D.

Disertační práce

Molecular and functional analysis of casein kinase 1 biology

Anotace:

Wnt/β-kateninová signální dráha, známá také jako kanonická Wnt dráha, je základním kamenem embryonálního vývoje a homeostázy dospělých tkání a její deregulace je častou příčinou lidských onemocnění, včetně rakoviny. Ačkoli jsou členové rodiny kasein kinázy 1 (CK1) považováni za ústřední hráče Wnt/β-kateninové signalizace, jejich přesné a často rozporné role představují dlouhodobé nejasnosti. Dosavadní poznatky považují CK1α za klíčový negativní regulátor, který iniciuje degradaci β-kateninu prostřednictvím fosforylace na serinu 45, zatímco CK1δ a CK1ε jsou považovány za vzájemně redundantní pozitivní regulátory, které působí na úrovni proteinu Dishevelled a signalosomu. Molekulární základ, kterým tyto vysoce homologní kinázy dosahují tak diametrálně odlišných funkcí, a funkční důsledky jejich izoforem a sestřihových variant, však zůstával z velké části nevyřešen. Tato doktorská práce se snaží objasnit tyto kritické mezery prostřednictvím komplexního experimentálního přístupu zahrnující: knockoutové buněčné linie připravené metodou CRISPR/Cas9, funkční reintrodukční testy (tzv. rescue assays), studie proteinových chimér, analýzu interaktomu, in vitro kinázové testy a farmakologickou modulaci. Výzkum si klade za cíl objasnit specifické funkce izoforem a sestřihových variant CK1, identifikovat strukturní determinanty jejich specificity, odhalit potenciální kompenzační mechanismy a přispět k vývoji selektivních modulátorů CK1. Prezentovaná práce zahrnuje tři klíčové studie. První z nich přináší komplexní analýzu přirozeně se vyskytujících sestřihových variant CK1α a jejího dosud málo prozkoumaného paralogu, CK1α-like. Využitím knockoutových buněčných linií vytvořených metodou CRISPR/Cas9 jsme prokázali, že CK1α je účinný a nezbytný negativní regulátor Wnt/β-kateninové dráhy, což je funkce, kterou s CK1α-like nesdílí. Prostřednictvím systematických reintrodukčních experimentů odhalujeme, že pouze specifická podskupina sestřihových variant CK1α dokáže účinně obnovit původní fenotyp v CK1α deficientních buňkách s hyperaktivovanou signalizací. Tato práce ukazuje, že schopnost fosforylovat β-katenin in vitro je nezbytná, avšak nikoli dostačující pro negativní regulační funkci v buněčném kontextu, což naznačuje na další úrovně regulace. Pravděpodobně na schopnost CK1α regulovat fosforylaci tzv. „scaffold“ proteinu Axin1. Druhá studie řeší přetrvávající paradox, jak mohou vysoce podobné izoformy CK1α a CK1ε vykazovat diametrálně odlišných funkcí. Funkční analýzou řady chimérických proteinů CK1α/CK1ε jsme identifikovali specifické strukturní domény zodpovědné za jejich odlišné buněčné role. Ukazujeme, že N-terminální strukturní doména CK1α je klíčovým determinantem, který ji směřuje do degradačního komplexu β-kateninu, což koreluje s jeho interakcí s tzv. „scaffold“ proteinem SACK1G (FAM83G). Naopak C-terminální konec CK1ε je nezbytný pro její navázání na DVL-dependentní signalosom, čímž zprostředkovává její pozitivní regulační funkci. Nejpřekvapivějším zjištěním této studie je objev významné funkční plasticity. V nepřítomnosti CK1α dochází k "přeprogramování" CK1δ a CK1ε, které se fyzicky asociují s degradačním komplexem a mění se z pozitivních na negativní regulátory dráhy. Tento funkční přechod, závislý na buněčném kontextu, zásadně mění naše chápání redundance CK1 a má zásadní dopady na terapeutické strategie. Třetí studie dále přispěla k charakterizaci farmakologických modulátorů, včetně vývoje MU1742, účinného a kinomově selektivního malomolekulárního inhibitoru CK1α/δ/ε, který je vhodný pro studie in cellulo a in vivo. Tento inhibitor se odli

Anotace:

šuje od dříve dostupných, méně selektivních, sloučenin. Závěrem, tato disertační práce přináší zásadní nové poznatky o komplexní biologii rodiny CK1 ve Wnt/β-kateninové signální dráze. Objasňuje odlišné role sestřihových variant CK1α a jejich neredundantní vztah s CK1α-like v kanonické Wnt dráze. Identifikuje strukturní determinanty, které řídí protichůdné funkce CK1α a CK1ε, a odhaluje neočekávanou, kontextově závislou funkční plasticitu mezi izoformami CK1. Tato zjištění řeší klíčové a dlouholeté nejasnosti v oboru a poskytují nový rámec pro pochopení složité regulace Wnt signalizace pomocí CK1. Tento hlubší mechanistický vhled je zásadní pro vývoj účinnějších a bezpečnějších terapeutických strategií zaměřených na rodinu CK1 v léčbě rakoviny a dalších onemocnění.

Abstract:

The Wnt/β-catenin signaling pathway, also known as canonical Wnt pathway, is a cornerstone of embryonic development and adult tissue homeostasis, and its dysregulation is a common driver of human diseases, including cancer. While Casein Kinase 1 (CK1) family members are recognized as central players in Wnt/β-catenin signaling, their precise and often paradoxical roles present long-standing ambiguities. The prevailing understanding posits CK1α as a key negative regulator, initiating β-catenin degradation through phosphorylation at S45, while CK1δ and CK1ε are considered mutually redundant positive regulators, acting at the level of Dishevelled and the signalosome. However, the molecular basis for how these highly homologous kinases achieve such diametrically opposed functions, and the functional implications of their various isoforms and splice variants, has remained largely unresolved. This doctoral study addresses these critical gaps through a comprehensive experimental approach utilizing CRISPR/Cas9-generated knockout cell lines, functional rescue assays, protein chimera studies, interactome analysis, in vitro kinase assays, and pharmacological modulation. The research aims to clarify the specific functions of CK1 isoforms and splice variants, identify the structural determinants of their specificity, uncover potential compensatory mechanisms, and contribute to the development of selective CK1 modulators. The work presented here is based on three core studies. The first study provides a comprehensive analysis of the naturally occurring splice variants of CK1α and its poorly characterized paralog, CK1α-like. Using CRISPR/Cas9-generated knockout cell lines, we demonstrate that CK1α is a potent, non-redundant negative regulator of the Wnt/β-catenin pathway, a role not shared by CK1α-like. Through systematic rescue experiments, we reveal that only a specific subset of CK1α splice variants can effectively rescue the phenotype of hyperactivated signaling in CK1α-deficient cells. This work establishes that the ability to phosphorylate β-catenin in vitro is necessary but not sufficient for the negative regulatory function in a cellular context, pointing to additional layers of regulation, possibly the ability of CK1α to regulate the phosphorylation of the scaffold protein Axin1. The second study resolves the long-standing paradox of how the highly similar CK1α and CK1ε isoforms achieve diametrically opposed functions. Through the functional analysis of a series of CK1α/CK1ε chimeric proteins, we identified the specific structural domains responsible for their distinct cellular roles. We demonstrate that the N-terminal lobe of CK1α is the key determinant directing CK1α’s localization to the β-catenin destruction complex and correlates with its interaction with the scaffolding protein SACK1G (FAM83G). Conversely, the C-terminal tail of CK1ε is essential for its recruitment to the DVL-dependent signalosome, driving its positive regulatory function. The most striking finding of this study is the discovery of profound functional plasticity. In the absence of CK1α, CK1δ and CK1ε are rewired, they physically associate with the destruction complex and switch from being positive to negative regulators of the pathway. This context-dependent functional switch fundamentally reframes our understanding of CK1 redundancy and has critical implications for therapeutic strategies. Furthermore, the third study contributed to the characterization of pharmacological modulators, including the development of MU1742, a potent and kinome-wide selective CK1α/δ/ε small-molecule inhibitor suitable for in cellulo and in vivo studies, distinguishing it from less selective compounds previously available. In conclusion, this dissertation provides substantial novel insights into the complex biology of the CK1 family in Wnt/β-catenin signaling. It clarifies the distinct roles of CK1α splice variants and their non-redundant relationsh

Abstract:

ip with CK1α-like in the canonical Wnt pathway. It identifies the structural determinants governing the opposing functions of CK1α and CK1ε and reveals an unexpected context-dependent functional plasticity among CK1 isoforms. These findings resolve key, long-standing ambiguities in the field and provide a new framework for understanding the intricate regulation of Wnt signaling by CK1. This deeper mechanistic insight is crucial for developing more effective and safer therapeutic strategies that target the CK1 family in cancer and other diseases.

Keywords

kasein kináza 1 (CK1), Wnt/β-kateninová dráha, kanonická Wnt dráha, izoformy, redundance, sestřihové varianty, SACK1 (FAM83), CRISPR/Cas9, casein kinase 1 (CK1), Wnt/β-catenin pathway, canonical Wnt pathway, isoforms, redundancy, splice variants

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 8. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 9. 2025
• Vedoucí: prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Marie Macůrková, Ph.D., dr. Lucie Wolf

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Fyziologie, imunologie a vývojová biologie živočichů / Fyziologie, imunologie a vývojová biologie živočichů