Aplikace moderních mikrokolonových separačních metod spojených s hmotnostní spektrometrií pro analýzu neinvazivních biologických vzorku

Mgr. Věra Dosedělová, Ph.D.

Doctoral thesis

Application of modern microcolumn separation methods coupled to mass spectrometry for analysis of non-invasive biological samples

Anotácia:

Sliny a kondenzát vydechovaného vzduchu (KVV) se řadí mezi atraktivní biologické tekutiny v klinickém výzkumu díky jednoduchému, bezpečnému a neinvazivnímu odběru vzorku a bohatému metabolomu, který byl studován za účelem identifikace možných biomarkerů. Tato disertační práce je zaměřena na analýzu žlučových kyselin, které se pravděpodobně podílejí na vzniku Barrettova jícnu. Z důvodu možné neinvazivní diagnostiky Barrettova jícnu byly zkoumány hladiny žlučových kyselin ve slinách a KVV. Diskutovány byly aspekty odběru a přípravy vzorku pomocí extrakce na pevné fázi a analýzy žlučových kyselin pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie na obrácených fázích a hmotnostní spektrometrie (UHPLC-MS). Pro kvantifikaci nekonjugovaných žlučových kyselin a jejich konjugátů s glycinem byla vyvinuta citlivá UHPLC-MS metoda. Vysokorozlišovací MS a iontová mobilita byly využity pro zkoumání fragmentace a k identifikaci nových žlučových kyselin ve slinách. U pacientů s Barrettovým jícnem byly ve slinách zjištěny signifikantně vyšší (p < 0,05) hladiny žlučových kyselin než u zdravých dobrovolníků. Ve slinách zdravých dobrovolníků byly také identifikovány taurinové konjugáty žlučových kyselin na základě iontové mobility, přesné hmotnosti a spekter iontových produktů. KVV byl odebrán pomocí nového, jednoduchého a levného přístroje, který během odběru vzorku udržoval stabilní teplotu -7 °C nebo +12 °C. Většina žlučových kyselin nebyla ve vzorcích KVV od zdravých dobrovolníků detekována. Aby byla tato metoda validována pro neinvazivní diagnostiku Barrettova jícnu, bude provedena větší klinická studie zahrnující i analýzu taurinových konjugátů žlučových kyselin ve slinách. Vyvinutá metodologie není vhodná pro analýzu žlučových kyselin v KVV, proto bude potřeba podrobnější optimalizace přípravy vzorku.

Abstract:

Saliva and exhaled breath condensate (EBC) are attractive biological fluids in clinical research due to simple, safe, and non-invasive sample collection and rich metabolome that has been investigated for the identification of possible biomarkers. This doctoral thesis is focused on the analysis of bile acids that have been proposed to play a major role in the development of Barrett’s esophagus. Bile acid levels in saliva and EBC were investigated for a possible non-invasive diagnosis of Barrett’s esophagus. Aspects of sample collection and preparation by solid-phase extraction and bile acid analysis by reversed-phase ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS) were discussed. A sensitive UHPLC-MS method was developed for the quantification of unconjugated and glycine-conjugated bile acids. High-resolution MS and ion mobility were utilized for the investigation of fragmentation patterns and the identification of new bile acids in saliva. Levels of bile acids were significantly higher (p < 0.05) in saliva from patients with Barrett’s esophagus compared to healthy volunteers. Based on ion mobility, accurate mass, and product ion spectra, taurine-conjugated bile acids were identified in saliva from healthy volunteers. EBC was collected by a novel, simple and inexpensive device that maintained a stable temperature of -7 °C or +12 °C during EBC collection. The majority of bile acids were not detected in EBC samples from healthy volunteers. In summary, a larger clinical study including taurine-conjugated bile acids in saliva will be performed in future research to validate the applicability of bile acids in non-invasive diagnostics of Barrett’s esophagus. Furthermore, the current methodology is unsuitable for bile acid analysis in EBC, and further optimization of sample preparation is required.

Keywords

Arduino, Barrettův jícen, žlučové kyseliny, kondenzát vydechovaného vzduchu, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, sliny, odběr vzorku Arduino, Barrett’s esophagus, bile acids, exhaled breath condensate, high-performance liquid chromatography, mass spectrometry, saliva, sample collection

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 11. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 12. 2022
• Vedúci: doc. RNDr. Petr Kubáň, Ph.D.
• Oponent: Ing. Karel Klepárník, CSc., doc. RNDr. Jiří Urban, Ph.D., Assoc. Prof. Michal Wozniakiewicz, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Life Sciences / Life Sciences