The RNA Polymerase II C-terminal domain: Condensation and interaction hub in transcription

Mgr. Kateřina Linhartová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Transkripce genů kódujících proteiny je úzce regulována flexibilní C-koncovou doménou (CTD) RPB1, největší podjednotkou RNA polymerázy II (RNAPII). RNAPII CTD je vysoce flexibilní doména složená z 52 heptapeptidových repetic s konzervovanou sekvencí YSPTSPS. Hraje klíčovou roli při koordinaci transkripce a s ní spojených procesů. Regulace CTD je zajištěna dynamickými post-translačními modifikacemi (PTM), které jsou specifické pro jednotlivé fáze transkripce. Tyto modifikace v 52 heptapeptidových repeticích CTD umožňují jejich rozpoznání různými transkripčními faktory. Současný výzkum naznačuje, že RNAPII CTD u lidí rovněž tvoří transkripční kondenzáty jak in vitro, tak in vivo. Tyto kondenzáty pravděpodobně vznikají prostřednictvím fázové separace. Tento jev představuje další možnou úroveň regulace transkripce. Hlavním cílem projektu představeného v této disertační práci bylo zkoumat, jak konzervovaná rezidua v RNAPII CTD ovlivňují její schopnost fázově separovat a jak tento proces následně ovlivňuje fosforylaci CTD komplexem CDK7. Fluorescenční mikroskopické analýzy provedené in vitro odhalily, že rezidua CTD heptád lze rozdělit do dvou skupin: (1) tyrosinová a prolinová rezidua ovlivňují schopnost CTD fázově separovat, zatímco (2) serinová a threoninová rezidua tento proces modulují. Další in vitro experimenty ukázaly, že fázová separace urychluje fosforylaci CTD zprostředkovanou CDK7 komplexem, přičemž CDK7 komplex se vyskytuje na povrchu CTD kondenzátů. Práce se dále zaměřila na lidský transkripční faktor RPRD2, který rozpoznává fosforylovanou CTD RNAPII. Přesná funkce RPRD2 v transkripčním cyklu však zatím zůstává nedostatečně objasněna. Za účelem podrobnějšího popisu interakce mezi RPRD2 CID a CTD fosforylovanou na serinu 2 a 7 (pS2,7) nebo threoninu 4 (pT4) byly pomocí NMR spektroskopie vyřešeny struktury obou komplexů. Fosforylace pS2 a pT4 CTD probíhá během pozdní elongace a terminace u kvasinek i lidí. Tato studie ukazuje, že RPRD2 preferenčně váže právě tyto fosforylační značky. Podobnost s kvasinkovým terminačním faktorem Rtt103 naznačuje, že RPRD2 by mohl hrát roli v pozdní elongaci nebo terminaci transkripce. Kombinace biofyzikálních a strukturních metod použitých v této práci přináší detailní pohled na to, jak rezidua CTD a jejich modifikace ovlivňují tvorbu kondenzátů i interakce s konkrétními specifickými transkripčními faktory. Tyto poznatky zdůrazňují význam CTD v regulaci transkripce.

Abstract:

The transcription of protein-coding genes is tightly regulated by the flexible C-terminal domain (CTD) of RPB1, the largest subunit of RNA Polymerase II (RNAPII). The RNAPII CTD is a highly flexible domain composed of 52 heptapeptide repeats with the consensus sequence YSPTSPS and plays an important role in coordinating transcription and co-transcriptional processes. This regulation is mediated by dynamic, transcription phase-specific post-translational modifications (PTMs) of residues within the CTD's 52 heptapeptide repeats, which are recognized by various transcription and RNA-processing factors. Evidence suggests that the human RNAPII CTD also forms transcriptional clusters in vitro and in vivo, potentially through phase separation. This phenomenon introduces another possible layer of transcriptional regulation through the spatial organization of this process. The focus of the main project presented in this doctoral thesis was on addressing how conserved residues of the RNAPII CTD influence its ability to undergo phase separation and how this process, in turn, impacts CTD phosphorylation by the CDK7 complex. In vitro fluorescence microscopy assays revealed that the CTD heptad residues can be divided into two groups: tyrosine and proline residues, which drive phase separation, and serine and threonine residues, which modulate it. Additionally, in vitro assays showed that phase separation enhances CDK7-mediated CTD phosphorylation, with the CDK7 complex associating at the surface of the CTD condensates. Furthermore, the human transcription factor RPRD2 recognizes phosphorylated RNAPII CTD, but its interaction with the CTD and precise role in the transcription cycle remain poorly understood. To provide details of the interaction between the RPRD2 CID and CTD phosphorylated on serine 2 (pS2) or threonine 4 (pT4) CTD, the solution structures of both complexes were determined using NMR spectroscopy. RNAPII CTD pS2 and pT4 phosphorylation occur during late elongation and termination in yeast and humans. RPRD2’s preference for these phospho-marks shown in this study, and its similarity to the yeast transcription termination factor Rtt103, suggests the possible involvement of RPRD2 in late elongation or transcription termination. Altogether, the combination of biophysical and structural studies used in this work provides deeper insights into how CTD residues and their modifications influence condensate formation and interactions with specific transcription factors, highlighting their importance in transcription regulation.

Keywords

RNAPII, CTD, transkripce, kondenzáty, CDK7, RPRD2, CID, LLPS, fazová separace, transcription, condensates, phase separation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 2. 2025

Thesis defence

• Date of defence: 3. 3. 2025
• Supervisor: prof. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.
• Reader: prof. Ing. Richard Hrabal, CSc., prof. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D., Univ.-Prof. PD Mag. Dr.rer.nat. Tobias Madl

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Life Sciences