Sekvence a funkční analýza krátkého ramene chromozómu 7D pšenice

Mgr. Zuzana TULPOVÁ

Disertační práce

Sequence and fuctional analysis of of the short arm of wheat chromosome 7D

Abstract:

Bread wheat (Triticum aestivum L.) is a staple food for ~40 % of world's population and belongs, together with rice and corn, among the most important crop species. Until recently, any wheat genomics study was a challenge, mainly due to its huge genome size (~16 Gb), high content of repetitive sequences (85 %) and presence of three sub-genomes. Aiming to overcome these obstacles and obtain a complete wheat reference genome sequence, the International Wheat Genome Sequencing Consortium proposed a strategy involving separation of individual chromosomes and their arms by flow cytometry. These were used to construct chromosome-specific BAC libraries and BAC-based physical maps, which became the basic resources for sequencing the wheat genome. Within a framework of this thesis, I focused on the short arm of wheat chromosome 7D (7DS). A previously constructed 7DS physical map was used to select the minimal set of BAC clones covering the arm, which were sequenced by Illumina pair-end and mate-pair sequencing and assembled. Contigs of the physical map were anchored on the chromosome using one radiation hybrid map and three high resolution genetic maps. Thus we assigned 73 % of the assembly to distinct genomic positions. The process of physical-map assembly and anchoring included the integration of the 7DS physical map with a whole-genome physical map of Aegilops tauschii and a 7DS Bionano genome (BNG) map, which together enabled efficient scaffolding of physical-map contigs even in the non-recombining region of the genetic centromere. Moreover, this approach facilitated a comparison of bread wheat and its ancestor at BAC-contig level and revealed a reconstructed region in the 7DS pericentromere. The obtained 7DS physical map, BAC assemblies and the BNG map were then applied as supporting resources for assembling and validating the reference genome of bread wheat and for a gene cloning project. The chromosome arm 7DS carries multiple genes underlying agronomically important traits, including a Russian wheat aphid resistance gene Dn2401, the cloning of which was the aim of the second part of the thesis. Previously, we mapped Dn2401 into an interval of 0.83 cM and spanned it with five BAC clones. Within the framework of this thesis, we used a targeted strategy combining traditional approaches towards gene cloning, comprising genetic mapping and Illumina sequencing of BAC clones, with novel technologies, including optical mapping and long-read nanopore sequencing. The latter, with reads spanning the entire length of a BAC insert, enabled us to assemble the whole region, the task not achievable with short reads. Long-read optical mapping validated the DNA sequence in the interval and revealed a difference in the locus organization between resistant and susceptible genotypes. The complete and accurate sequence of the Dn2401 region facilitated identification of new markers and precise annotation of the interval, revealing six high-confidence genes, including Epoxide hydrolase 2 as the most likely Dn2401 candidate.

Abstract:

Pšenice setá (Triticum aestivum L.) je zdrojem potravy pro přibližně 40 % světové populace a patří tak společně s rýží a kukuřicí k nejvýznamnějším zemědělským plodinám. V nedávné minulosti představovalo jakékoli studium pšeničného genomu velkou výzvu, a to především díky značné velikosti genomu (~16 Gb), vysokému obsahu repetitivních sekvencí (85 %) a přítomnosti tří homeologních subgenomů. Řešení těchto problémů přinesla strategie založená na třídění jednotlivých chromozómů a jejich ramen pomocí průtokové cytometrie, z nichž byly následně tvořeny knihovny dlouhých insertů a fyzické mapy, jež představovaly základní genomové zdroje pro získání kompletní referenční sekvence. Předkládaná práce se zabývá studiem krátkého ramene chromozómu 7D pšenice. S pomocí již dříve sestavené fyzické mapy 7DS byla vybrána minimální sestava BAC klonů, která reprezentuje celé rameno 7DS (tzv. minimal tilling path, MTP). Klony MTP pak byly osekvenovány pomocí platformy Illumina a sestaveny do sekvenčních kontigů. Pro ukotvení kontigů fyzické mapy byly využity tři genetické mapy s vysokým rozlišením a mapa radiačních hybridů. Díky tomu se podařilo určit konkrétní genomovou pozici pro 73 % sestavené mapy. Jedním z přístupů pro ukotvení fyzické mapy bylo i využití integrace fyzické mapy ramene 7DS s celogenomovou fyzickou mapou Aegilops tauschii a Bionano optickou mapou ramene 7DS. Kombinace těchto zdrojů umožnila efektivní ukotvování kontigů fyzické mapy, včetně nerekombinující oblasti genetické centromery, ale i bezprostřední porovnání pšenice s jejím předchůdcem. Díky tomu se podařilo identifikovat přestavby na úrovni BAC kontigů v pericentromerické oblasti ramene 7DS. Kromě toho byly ukotvená fyzická mapa, sekvence BAC klonů a optická mapa ramene 7DS využity jako podpůrné zdroje pro sestavení a kontrolu referenční sekvence pšenice a navazující projekt pozičního klonování. Rameno 7DS je nositelem celé řady genů pro agronomicky významné znaky, mezi něž patří i gen Dn2401 podmiňující rezistenci ke mšici zhoubné. Závěrečná část dizertační práce je věnována projektu pozičního klonování tohoto genu. V předchozí studii byla pomocí genetického mapování stanovena velikost intervalu, v němž se gen Dn2401 nachází, na 0.83 cM. Současně bylo identifikováno pět BAC klonů fyzické mapy, které daný interval překlenují. V rámci předkládané práce byla zvolena strategie kombinující tradiční přístupy klonování genů, jako jsou genetické mapování a sekvenování BAC klonů na platformě Illumina, s novými technologiemi zahrnujícími optické mapování nebo sekvenování pomocí nanoporů. Takto získaná dlouhá čtení, která překlenula celý insert sekvenovaného BAC klonu, pak umožnila sestavení kontinuální sekvence celého intervalu. Optické mapování následně potvrdilo správnost sekvence a odhalilo rozdíly mezi rezistentním a citlivým genotypem. Kompletní a přesná sekvence zájmové oblasti umožnila identifikaci nových markerů a detailní anotaci, která odhalila šest genů kódujích proteiny, včetně Epoxid hydrolázy 2 jakožto nejpravděpodobnějšího kandidáta genu Dn2401.

Keywords

Pšenice setá, Triticum aestivum, fyzická kontigová mapa, BAC, mšice zhoubná, Diuraphis noxia, rezistence, poziční klonování genů

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 20. 3. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Hana Šimková, CSc., Ing. Hana Šimková, CSc.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie