Vývoj metody na stanovení methotrexátu metodou kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí

Patrik MATLAK

Bachelor's thesis

Method development for determination of methotrexate by liquid chromatography with mass spectrometry

Abstract:

Metotrexát podle mechanizmu cytostatického účinku řadíme mezi inhibitory bází nukleových kyselin. V závislosti na plazmatické koncentraci lze predikovat jeho účinek a zamezit jeho toxicitě. Cílem bakalářské práce bylo vyvinout a validovat metodu na stanovení metotrexátu a jeho metabolitu 7-hydroxymetotrexátu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s hmotnostní detekcí v séru. Separace probíhala na koloně Acquity UPLC RP BEH C18 za použití izokratické eluce s dobou analýzy 5 min. Jako způsob ionizace byl použit elektrosprej v pozitivním módu (ESI+). Metoda pro stanovení metotrexátu a jeho metabolitu byla validována dle FDA pravidel. Kalibrační křivky jsou lineární v celém rozsahu testovaných koncentrací s korelačními koeficienty 0,999 a 0,999 pro metotrexát a 0,996 pro7-hydroxymetotrexát. Opakovatelnost, reprodukovatelnost a pravdivost byla testována na 6 hladinách pro metotrexát a na 3 hladinách pro 7-hydroxymetotrexát. Variační koeficienty metody se nachází v rozmezí 2,11 - 14,57 % a výtěžnost v rozmezí 95,71 ? 113,2 %. Metoda hmotnostní detekce byla porovnána s rutinně používanou metodou HPLC na 57 pacientských vzorcích, které dokázaly, že metoda je vhodná pro rutinní práci v laboratoři.

Abstract:

Methotrexate is classified as an inhibitor of nucleic acids due to his cytostatic mechanism. Its effect and toxicity can be predicted depending on its plasma contretration. The aim of the bachelor thesis was to develop and validate a method for determination of methotrexate and his metabolite 7-hydroxymethotrexate by high-performance liquid chromatography with mass spectrometry in serum. Separation was performed on an Acquity UPLC RP BEH C18 column using isoratic mobile phase with total analysis time of 5 minutes. Electrospray ionization metod in positive mode (ESI+) was used for ionization. Metod for determination of methotrexate and his metabolite was validated according to FDA guidelines. Calibtration curves were linea over the whole measuring range with correlation coeffients 0,999 a 0,999 for methotrexate and 0,996 for 7-hydroxymetotrexát. Repeatability, intermediate measurement precision and trueness were tested on 6 levels for methotrexate and on 3 for 7-hydroxymethotrexate. The coefficient of variations were from 2,11 to 14,57 %. The recovery range was from 95,71 to 113,24 %. Mass spectrometry method was compared with HPLC metod by analysing 57 patient samples, that proved this method suitable for routine clinical practice in laboratory.

Keywords

metotrexát, 7-hydroxymetotrexát, terapeutické monitorování léčiv, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, validace metody

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 4. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 6. 6. 2017
• Supervisor: Mgr. Romana Uřinovská, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Medicine

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Laboratory Assistant