Vývoj elektrochemické metody pro analýzu PCR amplikonů vybraných genomových sekvencí

Bc. Zdenka Vychodilová, Ph.D.

Diplomová práce

Development of an electrochemical technique for the analysis of PCR amplicons of selected genomic sequences

Anotace:

V rámci této diplomové práce byly zkoumány vlastnosti fragmentů DNA modifikovaných 7-deazapuriny, syntetickými analogy purinových bází, postrádajících atom dusíku v poloze 7 (ten je nahrazen skupinou C-H). V důsledku toho 7-deazapuriny nemohou vstupovat do Hoogsteenova párování a příslušně modifikovaná DNA nemůže vytvářet víceřetězcové sekundární struktury, čehož se využívá při některých aplikacích PCR. V této práci je ukázáno, že DNA, do níž byly pomocí DNA polymerázy začleněny 7-deazapuriny, částečně nebo plně nahrazující přirozené puriny, je možné snadno analyzovat pomocí elektrochemických metod. Na uhlíkové elektrodě poskytují oba 7-deazapuriny oxidační signály při výrazně méně pozitivních potenciálech, než jejich přirozené protějšky. Na rtuťové elektrodě 7-deazaguanin (na rozdíl od guaninu) neposkytuje anodický pík G ani žádný jiný specifický signál. Elektrochemická měření na rtuťové elektrodě dále ukázala, že pouze v případě dsDNA s rostoucím stupněm modifikace DNA 7-deazaadeninem dochází k výraznému růstu píků CA (v důsledku redukce cytosinu a adeninu, resp. 7-deazaadeninu) i píku G (v důsledku redoxních přeměn guaninu). To naznačuje sníženou stabilitu dvoušroubovice DNA obsahující vysoký podíl 7-deazaadeninu. Dále bylo zjištěno, že přítomnost 7-deazaguaninu (nikoli však 7-deazaadeninu) způsobuje výrazné zhášení fluorescence barviva SYBR Green I a že pro tento efekt je nutná interakce tohoto barviva s modifikovanou dsDNA. Pro sledování substituce guaninu 7-deazaguaninem byla využita jako chemická sonda cisplatina. Je známo, že pro tvorbu specifických aduktů cisplatiny s DNA je nezbytná jeho vazba na N7 guaninu. Elektrochemická analýza cisplatinových aduktů potvrdila výraznou inhibici jejich tvorby v případě DNA modifikované 7-deazaguaninem. Předběžná studie interakce fragmentů DNA modifikovaných 7-deazapuriny naznačila, že substituce guaninu 7-deazaguaninem výrazně inhibuje sekvenčně specifickou interakci proteinu p53 s takto modifikovanou DNA, zatímco substituce adeninu 7-deazaadeninem zesiluje nespecifickou interakci tohoto proteinu s DNA.

Abstract:

In this work fragments of modified DNA with 7-deazapurines, analogues of natural purine bases with substituted nitrogen in position 7 by C-H group, were analysed. Due to the absence of N7 7-deazapurines are incapable of forming Hoogsteen base pairs and DNA with these modified bases is not able to form multistranded DNA structures. In this work it has been shown that it is possible easily analyze DNA with enzymaticaly incorporated 7-deazapurines fully or partly replacing natural purines by electrochemical methods. At carbon electrode both 7-deazapurines yield oxidation peaks at less positive potencials compared to the natural adenine and guanine residues. At mercury electrode 7-deazaguanine does not yield peak G (which is produced by natural guanine) or any other specific signal (natural guanine does). Other electrochemical experiments showed increasing intensities of peak CA and peak G in case of increasing modification of dsDNA with 7-deazaadenine. This behaviour suggests a lower stability of DNA double helix with a high content of 7-deazaadenine. Further it was observed that incorporated 7-deazaguanine (not 7-deazaadenine) exhibits strong quenching of fluorescence of SYBR Green I indicator and that for this effect an interaction between SG and modified dsDNA is necessary. For studying guanine substitution by 7-deazaguanine, we utilized cisplatin as a chemical probe. It is well known that cisplatin gives specific adducts with DNA primarily through N7 of guanine. Electrochemical analysis of these cisplatin adducts confirmed strong inhibition of interaction with DNA modified with 7-deazaguanines. Preliminary study of 7-deazapurines-modified DNA fragments interaction with p53 protein suggests inhibition of sequence specific interaction in case of guanine substitution by 7-deazaguanine. Substitution of adenine by 7-deazaadenine enhances nonspecific interaction of p53 protein with modified DNA.

Klíčová slova

elektrochemická analýza, PCR, cisplatina, 7-deazapuriny, DNA-protein interakce electrochemical analysis, cisplatin, 7-deazapurines, DNA-protein interaction

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2011
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika