In vitro expanze a aktivace NK buněk pro účely buněčné terapie.

Monika BENEŠOVÁ

Bakalářská práce

In vitro expansion and activation of natural killer cells for cell therapy.

Anotace:

NK buňky jsou součástí nespecifické imunitní odpovědi a jsou jednou z hlavních složek protinádorové imunity. Ke své aktivaci nepotřebují antigenní stimul, ale rozeznávají poškozené (transformované) buňky podle snížené exprese MHC I molekul. Tito přirození zabíječi se stávají náplní mnoha klinických studií zabývající se využitím protinádorové aktivity NK buněk jak u solidních nádorů, tak u hemato-onkologických onemocnění. Cílem této práce bylo najít optimální podmínky pro in vitro expanzi a aktivaci NK buněk. NK buňky byly izolovány pomocí magnetické separace z frakce mononukleárních buněk a kultivovány ve dvou typech médií SCGM a X-VIVO 10 s přidáním interleukinu 2 popř. OKT3 protilátky. Dále byl sledován vliv přítomnosti podpůrných mononukleárních buněk na proliferaci NK buněk. Po 6-ti denní kultivaci byly buňky pasážovány a byl stanoven nárůst NK buněk a průtokovou cytometrií sledovány aktivační markery CD25 a CD336 (NKp44). Všechny experimenty probíhaly v podmínkách správné výrobní praxe. Mírně větší výtěžek NK buněk byl pozorován u SCGM média bez výrazného rozdílu v ostatních aditivech. Mezi kulturami s/bez přidání podpůrných buněk byl pozorován značný rozdíl ve prospěch kultury s podpůrnými ozářenými mononukleárními buňkami. Nebyl zaznamenán rozdíl v kulturách s autologními nebo alogenními buňkami. Pomocí průtokové cytometrie jsme zjistili, že NK buňky,které mají vyšší proliferační potenciál, exprimují ve větší míře CD25, na rozdíl od buněk s nižší proliferací, které měly zvýšenou expresi znaku CD336. Práce vedla k definici optimálních kultivačních podmínek pro NK buňky a stala se základem pro další vývoj léčivého přípravku z in vitro aktivovaných NK buněk.

Abstract:

NK cells are part of the non-specific immune response and are one of the main components of antitumor immunity. They do not need antigen stimul for thein activation but recognize damaged ( transformed ) cells by characteristic decreased expression of MHC I molecules. These natural killers become subjekt of many clinical studies based on the use of anti-tumor activity of NK cells for both solid tumors and in hemato - oncological diseases. The aim of this study was to find optimal conditions for in vitro expansion and activation of NK cells. NK cells were isolated from mononuclear cell fraction by magnetic separation and cultured in two types of media SCGM and X - VIVO 10 with the addition of interleukin-2 respectively OKT3 antibody. The influence of the mononuclear cells on proliferation of NK cells was tested. After a 6- day culture , the cells were passaged and growth of NK cells was determined using hematological analyzer and flow cytometry. Expression of the activation markers CD25 and CD336 (NKp44) was observed. All experiments were conducted under conditions of good manufacturing practice. Slightly higher gain of NK cells was observed in SCGM media without a significant differences in the other additives. Much higher number of NK cells was observed in culture with supporting irradiated mononuclear cells. There were no differences in cultures with autologous or allogeneic cells. We found that NK cells with higher proliferative potential express increasingly CD25, unlike the cells with decreased proliferation which had increased expression of CD336 marker. The work led to the definition of the optimal culture conditions for NK cells and became the basis for the further development of the medicinal product from in vitro activated NK cells.

Klíčová slova

NK buňky, kultivace, aktivita

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 5. 2014

Zveřejnit od: 5. 5. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Monika Holubová

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Zdravotně sociální fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Specializace ve zdravotnictví / Zdravotní laborant