Studium aneuploidií u embryí prasat metodou komparativní genomové hybridizace

Mgr. Miroslav Horňák, Ph.D.

Disertační práce

Investigation of aneuploidies in porcine embryos using comparative genomic hybridization

Anotace:

Přestože se numerické abnormality běžně vyskytují v raných lidských embryích a jsou pravděpodobně podstatným faktorem ovlivňujícím jejich mortalitu a následně selhání implantace, u hospodářských zvířat postrádáme obsáhlejší informace o frekvenci a charakteru těchto poruch. Chromozomové abnormality u zvířat byly doposud zkoumány metodu FISH nebo technikou konvenčního karyotypování, avšak metoda FISH poskytuje informace pouze o několika chromozomech a karyotypování spolehlivě detekuje pouze poruchy ploidie. Cílem této práce je aplikovat metody celogenomové amplifikace a komparativní genomové hybridizace (CGH) a přispět tak k rozšíření znalostí o chromozomových abnormalitách v prasečích embryích. Hlavní výhodou tohoto metodického přístupu je, že technika CGH detekuje aneuploidie všech chromozomů zároveň. Vyšetřovali jsme všechny chromozomy u raných prasečích embryí a prasečích blastocyst získaných in vivo a naší snahou bylo stanovit základní frekvenci a charakter chromozomových poruch. Prasečí embrya byla zlyzována a celogenomová amplifikace byla provedena metodou „multiple displacement amplification“ (MDA). V následné CGH byla amplifikovaná testovaná DNA porovnána s kontrolní DNA použitím rozdílného fluorescenčního značení a hybridizací na samčích mitózách prasete. Objevili jsme aneuploidie u 14,3 % raných prasečích embryí. Nalezli jsme chromozomové poruchy zahrnující ztrátu/zisk jednoho nebo několika chromozomů (10,4 %), ale i extenzivní chromozomové aberace (3,9 %). Chromozomy 8, 11, 12, 13, 17, X byly zapojeny do aneuploidií nejčastěji, v porovnání s chromozomy 2, 9, 18, které byly zapojeny do chromozomových poruch vzácně. Při vyšetřování prasečích blastocyst jsme objevili aneuploidie jen v 5,7 % všech blastocyst. Jelikož CGH neumožňuje detekci polyploidií, analyzovali jsme dále skupinu in vivo prasečích blastocyst metodou FISH za účelem evaluace poruch ploidie.

Abstract:

Although numerical chromosome errors are known to be prevalent in early human embryos and are likely to be a considerable factor influencing the mortality of early embryos and implantation failure, in farm animals, data about the frequency and nature of errors is rather limited. Concerning this topic, several works have utilized FISH analysis or conventional karyotyping so far, however FISH provides information about only a few specific chromosomes and karyotyping reliably detects only ploidy errors. The aim of this work is to apply the methods of Whole Genome Amplification (WGA) and Comparative Genomic Hybridization (CGH) and contribute to the comprehensive understanding of chromosome errors in porcine embryos. The main advantage of this approach is that CGH detects errors of all chromosomes simultaneously. We investigated the whole chromosome set of in vivo derived early porcine embryos and porcine blastocysts and tried to determine the basic frequency and nature of chromosome errors. Porcine embryos were lysed and underwent WGA by multiple displacement amplification (MDA). In a subsequent CGH, amplified test DNA was compared to control DNA using different fluorescent labeling and hybridization on male porcine mitoses. The 14.3% of early porcine embryos were observed to be aneuploid. We found chromosome errors comprising loss/gain of one or few chromosomes (10.4%) but also extensive chromosome imbalances (3.9%). Chromosomes 8, 11, 12, 13, 17, and X were most frequently involved in aneuploidies, when compared to chromosomes 2, 9, and 18, which were rarely involved in chromosome errors. When investigating porcine blastocysts, we discovered only 5.7% of them to be aneuploid. Since CGH is not capable of detecting of polyploidy, we analysed further the group of in vivo derived porcine blastocysts using FISH to evaluate the ploidy errors.

Klíčová slova

aneuploidie, chromozom, komparativní genomová hybridizace, prase, embryo aneuploidy, chromosome, comparative genomic hybridization, pig, embryo

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 12. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 12. 2010
• Vedoucí: prof. MVDr. Jiří Rubeš, CSc.
• Oponent: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc., prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Genetika