Stanovení metotrexátu chromatografickými metodami

Barbora CHODELKOVÁ

Bachelor's thesis

Determination of methotrexate by chromatographic methods

Abstract:

Cílem bakalářské práce bylo vyvinout a validovat metodu vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na stanovení metotrexátu. Separace metotrexátu proběhla na koloně Gemini C18, 5 ?m, 150 x 2 mm, za použití izokratické eluce mobilní fáze (voda:metanol:acetonitril:triethylamin; ph 4,8) s dobou analýzy 12 minut. Koncentrace metotrexátu je stanovována ze séra. Úprava vzorku zahrnuje srážení proteinů pomocí směsi kyseliny chloristé, hydroxidu sodného a vody. Kalibrační křivky jsou lineární v celém rozsahu testovaných koncentrací s korelačními koeficienty 0,998 a 0,9998. Opakovatelnost, reprodukovatelnost a pravdivost byla testována na 4 hladinách. Variační koeficienty jsou nižší než 10%. Výtěžnost metody se pohybuje v rozmezí 88,24 ? 108,4 %. Následně byla metoda HPLC porovnána s imunoanalytickou metodou analýzou 31 pacientských vzorků, která ukázala, že metodu lze zavést do rutinní praxe. Pomocí této metody lze stanovit koncentraci metotrexátu v séru v krátkém čase a s jednoduchou úpravou vzorku.

Abstract:

The aim of this bachelor thesis was to develope and validate the method of high performance liquid chromatogramy (HPLC) for determination of methotrexate (MTX). Separation of MTX was performed on the column Gemini C18, 5 ?m, 150 x 2 mm, using the mobile phase with isocratic elution (water:methanol:acetonitrile:triethylamine, pH 4,8), and total analysis time was 12 minutes. The concentration of MTX was determined in serum. Sample preparation involved precipitation of protein using a mixture of perchloric acid, sodium hydroxide and water. The calibration curves were linear over the whole measuring range, and correlation coefficients were 0.998 and 0.9998. Repeatability, reproducibility and trueness were tested to 4 levels. The coefficient of variation was less than 10%. The recovery ranged from 88.24 to 108.4 %. Analysis of 31 patients samples by both HPLC method and Fluorescence polarization immunoassay has proved the appropriateness of introducing HPLC method in to routine clinical practice. This method enables determination of MTX concentration in serum in short time and with simple preparation of the sample.

Keywords

cytostatikum, metotrexát, terapeutické monitorování léčiv, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, validace metody

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 4. 2014

Accessible from:: 30. 4. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2014
• Supervisor: Mgr. Romana Uřinovská, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Medicine

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Laboratory Assistant