Regulace exprese a stability transkripčních faktorů SNAI2/Slug a Twist u transformovaných epiteliálních buněk prostaty

Bc. Stanislav Lerch

Diplomová práce

Regulation of expression and stability of transcription factor SNAI-Slug and Twist in transformed prostate epithelial cells

Anotace:

Pokročilé stádium nádorového onemocnění prostaty je spojeno se vznikem metastáz, které jsou podmíněny zvýšenou schopností buněčné migrace a invaze. Epiteliálně mezenchymální přechod (EMT) je proces přeměny těsně spojených epiteliálních buněk v buňky s mezenchymálním fenotypem a se zvýšenou schopností migrace a invaze. Ke klíčovým transkripčním faktorům regulujícím EMT a schopnostem buněčné migrace na modelu benigních a transformovaných buněk prostaty patří SNAI2/Slug a Twist. Ovlivnění specifické regulace exprese a/nebo stability těchto transkripčních faktorů u nádorových buněk by mohlo vyústit v novou strategii prevence metastazujícího nádorového onemocnění. Pro studium regulace exprese transkripčních faktorů SNAI2/Slug a Twist (u benigních a nádorově transformovaných buněčných linií odvozených z epitelu prostaty) byly použity metody: westernový přenos, qRT-PCR, analýza aktivity promotoru, imunofluorescenční mikroskopie a cytokinová "array". U tumorigenních linií BPH-1, které mají zvýšenou schopnost invaze a migrace, byly zjištěny zvýšené hladiny transkripčních faktorů Slug a Twist, v porovnání s benigní parentální linií BPH-1, na úrovni mRNA i proteinů. Tyto hladiny pozitivně korelovaly s hladinou mezenchymálního znaku Vimentinu u tumorigenních linií BPH-1. Použitím farmakologických inhibitorů translace nebo proteazomální degradace byl určen poločas života transkripčních faktorů Slug a Twist. Rozdíly v poločase života ukázaly zvýšenou stabilitu a zpomalenou proteazomální degradaci transkripčních faktorů Slug a Twist u tumorigenních linií BPH-1 v porovnání s nenádorovou parentální linií BPH-1. Analýza kondiciovaných médií, s cílem odhalit možné autokrinní dráhy produkce cytokinů z podrodiny TGF-β, které jsou účinnými induktory EMT, neodhalila zvýšenou produkci cytokinů TGF-β1, TGF-β2 a TGF-β3 u tumorigenních linií BPH-1 v porovnání s parentální linií. Výsledky získané v rámci této diplomové práce svědčí o tom, že rozdílné hladiny exprese transkripčních faktorů Slug a Twist, u linií odvozených z benigní hyperplazie prostaty, jsou způsobeny prostřednictvím více mechanismů zodpovědných za regulaci stability a degradace na úrovni proteinů i mRNA.

Abstract:

Advanced stage of prostate cancer is associated with metastasis, a process dependent on enhanced ability of cell migration and invasiveness. Epithelial mesenchymal transition (EMT) is a conversion process of tightly adherent epithelial cells in a cell with a mesenchymal phenotype and increased ability to migrate and invade. The key transcription factors regulating EMT and ability of cell migration in the model of benign and transformed prostate cells are SNAI2/Slug and Twist. Modulating the specific regulation of expression and/or stability of these transcription factors could lead to a new strategy to prevent metastatic disease. To study the regulation of expression of transcription factors SNAI2/Slug and Twist, in benign and tumor-transformed cell lines derived from the prostate epithelium, the following methods were used: western blotting, quantitative real-time PCR, analysis of promotor activity, immunofluorescence microscopy and cytokine array. The tumorigenic lines BPH-1, which have an increased ability of invasion and migration, showed increased expression of transcription factors Slug and Twist, compared with benign parental line BPH-1, on the mRNA and protein level. These levels positively correlated with the level of mesenchymal marker Vimentin in tumorigenic lines BPH-1. Pharmacological inhibition of protein synthesis or proteasomal degradation, was used to determine the half-life of transcription factors Slug and Twist. Differences in half-life showed increased stability and slower proteasomal degradation of transcription factors Slug and Twist in tumorigenic lines BPH-1 compared to benign parental line BPH-1. Analysis of conditioned media, in order to detect possible autocrine pathways of cytokine production of TGF-β subfamily, which are potent inducers of EMT, revealed no increased production of cytokines TGF-β1, TGF-β2 and TGF-β3 in tumorigenic lines BPH-1 compared with the parental line BPH 1. The results obtained in this diploma thesis suggest, that the difference in expression levels of transcription factors Slug and Twist, in the lines derived from benign prostatic hyperplasia, are caused by a several mechanisms, responsible for regulating the stability and degradation at the mRNA and protein levels.

Klíčová slova

Slug, SNAI2/Slug, Twist, Twist1, transkripční faktor, EMT, epiteliálně mezenchymální přechod, prostata, transcription factor, epithelial to mesenchymal transition, prostate

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 6. 2013
• Vedoucí: Mgr. Karel Souček, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Molekulární biologie a genetika