Detekce poškození DNA pomocí PCR.

Bc. Eva KLEMENSOVÁ

Bakalářská práce

Detection of DNA damage by means of the polymerase chain reaction.

Anotace:

Tato práce je věnována poškození DNA alkylačními a oxidačními činidly. Cílem bylo izolovat plasmidové DNA s vhodnými sekvencemi pro metylaci jednořetězcových nebo dvouřetězcových úseků DNA. Dále bylo cílem ověřit možnost použití polymerázové řetězové reakce pro detekci DNA poškozené metylačními činidly a pokusit se optimalizovat podmínky pro detekci poškozené DNA. Vhodné sekvence pro metylaci mají plasmidy pPGM1 a pPGM2, které byly vytvořeny vložením palindromatické nukleotidové sekvence do pBluescript II SK(-) do místa vzniklého štěpením HindIII. Tato palindromatická sekvence má schopnost tvořit křížovou strukturu u pPGM2 a u pPGM1 méně ochotně. Plasmid pBluescript II SK(-) slouží jako kontrola pro srovnání. Křížová struktura obsahuje jednořetězcový úsek ? vlásenku, kde se naváže metylová skupina metylmetansulfonátu (MMS). Při polymerázové řetězové reakci dochází v místě vazby s metylovou skupinou k blokaci syntézy DNA (Taq DNA-polymeráza se zastaví). Po elektroforetické separaci lze vidět snižování množství nasyntetizovaných úseků DNA v důsledku zvyšování koncentrace MMS.

Abstract:

This bachelor thesis is intent on DNA damage produced with alkylating and oxidating agents. The first aim was plasmid DNA izolation, which includes suitable sequences for methylation of single-strand or double-strand DNA segments. The second aim was attest the possibility of usage polymerase chain reaction for DNA detection, which is damaged with methylating agents and try to optimize conditions for damaged DNA detection. The suitable sequences for methylation have plasmids pPGM1 and pPGM2. These plasmids include palindromic nucleotide sequence, which was insert in pBlescript II SK (-) in the place after HindIII cleavage. This palindromic sequence can form the cruciform scructure in pPGM2 and in pPGM1 less readily. Plasmid pBluescript II SK(-) serves as a control. The cruciform structure includes single-strand segment ? hairpin loop. The methyl group of methyl methanesulfonate (MMS) is linked to the hairpin loop. In the place with linked methyl group is the synthesis blocked (Taq DNA-polymerase is stopped) during polymerase chain reaction. After electroforetic separation are reduced synthesized DNA segments with increasing concentration of MMS.

Klíčová slova

Alkylační činidla, metylace DNA, metylmetansulfonát, etylmetansulfonát, N-metyl-N-nitrosomočovina, polymerázová řetězová reakce, agarózová gelová elektroforéza.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 6. 2009

Zveřejnit od: 25. 6. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 24. 8. 2009
• Vedoucí: RNDr. Petr Pečinka, Ph.D.

OSTRAVSKÁ UNIVERZITA V OSTRAVĚ

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biologie / Experimentální biologie