Stanovení vybraných proliferačních markerů a receptorů gonadotropních hormonů v oocyty obklopujících buňkách

Bc. Tereza Lodeová

Master's thesis

Chosen proliferation markers and ganadotropin hormones receptors determination in oocytes surrounding cells

Anotácia:

V této práci byla studována exprese receptorů gonadotropních hormonů a proliferačních markerů v kumulárních buňkách člověka a prasete. Zaměřili jsme se na detekci receptorů pro folikulostimulační a luteinizační hormon a detekci proliferačního markeru CD71 transferin R.V obou typech kumulárních buněk jsme detekovali receptor pro FSH. Síla signálu reakce antigenu s protilátkou proti FSHR na blotu byla vyjádřená na základě parametru integrované optické denzity (IOD), která je rovna součinu průměrné optické denzity a plochy v místě reakce antigenu s protilátkou. Aby bylo možné posuzovat množství proteinu v kumulárních buňkách, byly hodnoty integrované optické denzity vztaženy k hodnotě integrované optické denzity proteinu tubulinu v příslušném typu kumulárních buněk. Porovnávány byly vždy denzity proteinů na stejném blotu. Tubulin byl zvolen jako referenční protein, protože se vyskytuje ve všech eukaryotických buňkách. V porovnání s tubulínem se v kumulárních buňkách člověka i prasete vyskytuje vyšší množství proteinu FSHR.Dále bylo naším cílem v kumulárních buňkách člověka a prasete detekovat receptor pro luteinizační hormon. Podle doporučení výrobce byla použita primární králičí protilátka v koncentraci 1:2000. Po aplikaci chemiluminiscenčního substrátu a vyvolání přístrojem Azure c600 nebyl detekován žádný signál. Koncentraci použité protilátky jsme nejprve zdvojnásobili, později jsme koncentraci ještě upravili na 1:500, ale hledaný protein o molekulové hmotnosti 85 kDa se nám detekovat nepodařilo. Pro další experimenty bude vhodné zvolit protilátku od jiného výrobce s vyšší specifitou nebo změnit systém detekce proteinu.Dále jsme studovali expresi transferinového receptoru CD71. Hledaný protein se nám podařilo detekovat ve vzorcích obou typů kumulárních buněk. Síla signálu reakce antigenu s protilátkou proti CD71 receptoru na blotu byla stejně jako v případě FSHR vyjádřena na základě parametru integrované optické denzity a pro porovnání množství byly hodnoty IOD CD71 R vztaženy k hodnotě IOD tubulinu. V porovnání s tubulínem se v kumulárních buňkách člověka i prasete vyskytuje nižší množství CD71 R.V další fázi experimentů budou kumulární buňky člověka a prasete kultivovány. Během kultivace bude sledován jejich vývoj, proliferační aktivita a viabilita. Následně budou jednotlivé subpopulace buněk hodnoceny z hlediska jejich proliferace a diferenciace. Pro tento postup bude využito stanovení charakteristických mezenchymových markerů, jako jsou proteiny CD29 B1 integrin, či CD44 nebo CD 105 endoglin a také výše detekované markery proliferace jako je CD71 transferin R a receptory pro gonadotropní hormony.

Abstract:

In this thesis the expression of gonadotropic hormones receptors and proliferative markers were studied in human and porcine cumulus cells. We focused on the detection of follicle-stimulating and luteinizing hormone receptors, and the detection of the proliferation marker CD71 transferrin R.We detected receptors for FSH in both types of cumulus cells. The antigen response signal to anti-FSHR antibody on the blot was expressed on the basis of the integrated optical density parameter (IOD) which is equal to the product of the average optical density and the area at the antigen-antibody response. In order to assess the amount of protein in cumulus cells, the integrated optical density values were compared to the integrated optical density of the tubuline protein in the respective type of cumulus cells. Protein densities on the same blot were always compared. Tubulin had been selected as a reference protein because it occurs in all types of eukaryotic cells. Compared to tubulin, there is a higher amount of FSHR in human and porcine cumulus cells.Furthermore, our goal was to detect the luteinizing hormone receptor in human and porcine cumulus cells. According to recommendations of the manufacturer, a rabbit primary antibody at a ratio 1:2000 was used. After application of the chemiluminescent substrate and induction with Azure c600 no signal was detected. At first we doubled the concentration of the primary antibody used, and later we adjusted the concentration to 1:500, but the 85 kDa protein of interest was not detected. For further experiments, it would be appropriate to select the antibody with a higher specificity or to change the protein detection system.We also studied the transferrin receptor expression, CD71. We detected the protein in samples of both types of cumulus cells. The signal response strength of the antigen with the anti-CD71 receptor antibody on the blot was, as in the case of FSHR, expressed on the basis of the integrated optical density parameter, and the IOD of CD71 R values were referenced to the IOD value of tubulin for comparison. Compared to tubulin, there is a lower amount of CD71 R in both human and pig cumulus cells.In the next phase of the experiments, the human and porcine cumulus cells will be cultured. During cultivation, the cell’s development, proliferation activity, and viability will be monitored. Subsequently, individual cell subpopulations will be evaluated for theirproliferation and differentiation. For this procedure, determination of characteristic mesenchymal markers, such as endoglin CD29 B1 integrin or CD44 or CD105 proteins, as well as the proliferation markers detected above, such as CD71 transferrin R and gonadotropic receptors, will be utilized.

Kľúčové slová

Člověk, Prase, Markery proliferace, Receptory gonadotropních hormonů, Detekce proteinů, Western blot

Keywords

Human, Pig, Proliferation markers, gonadotropic hormone receptors, protein detection, Western blotting

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Ing. Eva Chmelíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / odbor:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology