Epigeneticky kontrolované změny exprese genů u nádorových onemocnění

Bc. Stanislav Stejskal, Ph.D.

Diplomová práce

Anotace:

cDNA microarrays je progresivní technika umožňující studovat, sledovat a porovnávat transkripční aktivitu až několika tisíců genů najednou a dává nám ucelený obraz o genové expresi. Použili jsme tuto techniku pro studium a definování transkripčního statusu vydiferencovaných neutrofilů (z buněčné linie HL-60), u kterých během procesu diferenciace do granulocytů dochází k výrazné změně tvaru buněčného jádra. Pro ex vivo studium granulopoézy jsme použili buněčnou linii HL-60. Pomocí cDNA microarrays techniky jsme porovnali změnu exprese v HL-60 buněčné linii, granulocytů diferencovaných z HL-60 pomocí DMSO a granulocytů získaných z periferní krve pacientů. Transformací dat získaných z cDNA do transkripčních map jsme vybrali chromosomální doménu s nízkou změnou exprese (upregulace nebo downregulace) v průběhu myeloidní diferenciace do neutrofilních granulocytů. Vybraná chromosomální doména splňovala nejlépe kritéria, která jsme si pro daný experiment stanovili. Vzhledem k tomu, že chromosom 19 nemění polohu svého těžiště během diferenciace, nejsou případné polohové změny upregulovaných či downregulovaných oblastí bezprostředně spojeny se změnou polohy celého chromosomálního teritoria a lze na nich sledovat změny spojené s lokálními posuny. Pro tento genetický lokus jsme připravili DNA sondy a pak jsem pomocí FISH techniky sledovali jeho prostorovou distribuci v jádře. V další části experimentu jsme pomocí imunoznačících metod sledovali distribuci heterochromatických a transkripčně aktivních oblastí v jádře. V této práci jsme potvrdili, že cDNA microarrays v kombinaci s FISH a imunoznačením je vynikající metoda pro výběr a sledování epigenetických mechanismů regulace genové exprese. Naše výsledky přinášejí nové informace o změně topografických parametrů genetických lokusů s malou změnou exprese a jaderné architektury v průběhu diferenciačních procesů nádorových buněk.

Abstract:

cDNA microarrays is an advanced technique that provides possibility of studing, monitoring and making comparison of transcription activity of more than thousands of genes at one moment and brings large scale view to gene expression. We have used this technique to study and define transcription statuses of differentiated granulocytes (from HL-60 cell line) that dramatically change nuclear shape during granulocyte differentiation process. We have used the HL-60 cell line to study ex vivo granulopoiesis. Using cDNA microarrays technique we have compared changes of gene expression in HL-60 cell line, in granulocytes differentiated from HL-60 by DMSO and granulocytes obtained from peripheral blood of patients. Using our microarrays data we have generated transcription maps. We have chosen chromosomal domain with low alternations of gene experession during myeloid differentiation to neutrophilic granulocyte. Selected chromosomal domains matched the requirements we have determined for our experiments in advance. Because of the fact that centre of gravity of chromosome 19 doesn't change its position during dufferentiation, positions of up-regulated or down-regulated domains are not linked with positional alteration of whole chromosomal territory, alterations linked with local displacement can be monitored. DNA probes marked by fluorescence have been prepared and used for FISH experiments studying spatial arrangement of genetic loci during granulopoiesis. In the other part of our experiments we have studied the distribution of heterochromatical and transcriptionally active domains in the nucleus. In this work we have confirmed that cDNA microarrays in combination with FISH and immunostaining is an excellent approach for dispatching and monitoring epigenetic mechanisms of gene expression. In conclusion, our data have provided new information about spatial arrangement and higher order nuclear organization during tumor cells differentiation processes.

Klíčová slova

cDNA microarrays, fluorescent in situ hybridization, FISH, immunostaining, spatial arrangement, chromosomal territory, neutrophil, HL-60, RNA polymerase II, HP1alpha, nucleus, fluorescenční in situ hybridizace, imunoznačení, prostorová distribuce, chromosomální teritoria, neutrofil, HP1 protein, chromatin

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 4. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 24. 5. 2006
• Vedoucí: RNDr. Irena Koutná, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Chemie / Biochemie