Evolution and function of alternative splicing in plants

Kseniya Timofeyenko, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Během celého životního cyklu je v organizmech citlivě regulována exprese genů na různých úrovních. Jedním z takových regulátorů je alternativní sestřih (AS). AS umožňuje vytváření více transkriptů RNA z jednoho genu. Reguluje časování a úroveň exprese genu a rozšiřuje proteomový repertoár. Avšak nikoli všechny produkované transkripty mají detekovatelnou biologickou roli. Některé z nich jsou také zbytné či chybně vytvořené RNA pocházející z inherentní nedokonalosti biologických procesů. Kritickou úlohou je tak rozlišit mezi řízenými sestřihovými událostmi přispívajícími k fitness organizmu a těmi, které nemají významnější fyziologickou roli. Má práce shrnuje různé funkční aspekty alternativního sestřihu (AS) se zvláštním zřetelem k rostlinám a jejich alternativních proteinových izoforem. Podílela jsem se významnou měrou na vypracování přehledového článku dokumentujícím základní principy fungování alternativních proteinů u rostlin (Kashkan et al., 2022a, Publikace 1). Zde shrnujeme, jak AS obecně ovlivňuje funkci proteinů změnou specifických strukturních motivů nebo např. generováním zkrácených izoforem, které mohou interferovat s rolí jejich plnohodnotných protějšků. Evoluční konzervovanost alternativních izoforem souvisí s jejich biologickým významem. Spoluvyvinula jsem algoritmický nástroj založený na strojovém učení nazvaný Catsnap, který detekuje (potenciálně) konzervované alternativní izoformy u rostlin a živočichů (Timofeyenko et al., 2023, Publikace 2). Na rozdíl od předchozích studií, které zohledňovaly konzervovanost samotných sestřihových událostí (tedy na úrovni RNA), náš program analyzuje aminokyselinové sekvence kódované alternativními transkripty. Pomocí tohoto programu jsme testovali konzervovanost experimentálně ověřených rostlinných proteinů vznikajících díky AS. Většina z nich má vskutku tendenci být konzervována napříč vzdálenými fylogenetickými skupinami rostlin. Testované alternativní proteiny však překvapivě vznikají rozličnými mechanismy na úrovni RNA, tedy z různých typů AS, alternativních transkripčních startů a alternativní polyadenylací. To podtrhává pozoruhodnou plasticitu AS u rostlin - ale méně u živočichů. Protože dosud žádný nástroj pro analýzu konzervovanosti alternativních izoforem běžně dostupný nebyl, rozšířili jsme Catsnap o uživatelsky přívětivé rozhraní dostupné na adrese https://catsnap.cesnet.cz/. Rovněž jsme využili nástroj Catsnap k výběru několika kandidátů pro experimentální ověření funkční role AS. Spolupracovala jsem na zavádění a testování fluorescenčních reportérů AS u rostlin. U vybraných genů Arabidopsis thaliana jsme byli schopni pozorovat aktivitu sestřihových událostí v různých pletivech in vivo. Toto úsilí bylo shrnuto v článku věnovaného vizualizaci AS u rostlin (Kashkan et al., 2020, Publikace 3).

Abstract:

During the whole life cycle of the organism, gene expression is carefully regulated at various levels. One of such crucial regulators is alternative splicing (AS). AS enables the generation of multiple RNA transcripts from a single gene. It regulates the timing and level of gene expression and expands the proteome repertoire. Not all generated transcripts, however, carry a detectable biological function and some of them are erroneous RNAs resulting from the inherent inaccuracy of biological processes. The important task is to distinguish between regulated events contributing to the organism’s fitness and those with neutral effect. My work summarizes various functional aspects of AS with a particular emphasis on plants and on their ability to generate novel protein isoforms. I have co-authored a comprehensive literature review on known functional examples of alternative proteins in plants (Kashkan et al., 2022a, Publication 1). The review summarizes how AS typically impacts protein function by regulating the presence of specific important motifs or, e.g., by generating shortened isoforms that can interfere with the functionality of their full-length counterparts. The evolutionary conservation of AS (alternative isoforms) correlates with their biological significance. I have co-developed a machine learning-based computational pipeline named Catsnap, which can track the evolution of putative conserved alternative isoforms in plants and animals (Timofeyenko et al., 2023, Publication 2). In contrast to previous studies, that took into account the conservation of AS events (that is, at the RNA level), our tool analyzes amino acid sequences of putative proteins encoded by alternative transcripts. We used Catsnap to test the conservation of experimentally validated plant proteins resulting from AS and confirmed indeed that most of them tend to be conserved across distant plant phylogenetic groups. Strikingly, we found that the tested alternative proteins arise from various mechanisms at the RNA level, including different types of AS events, alternative transcription start sites and alternative polyadenylation. Thus, we demonstrate a remarkable plasticity of AS in plants (but less in animals). In addition, no common tool was available for analyzing the conservation of alternative isoforms of interest up to date. We have extended our findings by designing a user-friendly interface available at https://catsnap.cesnet.cz/. We also used the Catsnap tool to select a number of candidates for experimental studies of the functional role of AS. As a part of this work, we have co-introduced a concept of fluorescent reporters in plants. For AS of selected Arabidopsis thaliana genes, we were able to monitor the activity of AS in various tissues in vivo. My work contributed to the published article dedicated to the visualization of AS in plants (Kashkan et al., 2020, Publication 3).

Keywords

alternativní sestřih, bioinformatika, konvergentní evoluce, hotspoty, izoformy, strojové učení, molekulární evoluce, transkriptom, alternative splicing, bioinformatics, convergent evolution, hotspots, isoforms, machine learning, molecular evolution, transcriptome

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 5. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 30. 6. 2023
• Supervisor: Mgr. Kamil Růžička, Dr. rer. nat.
• Reader: Dr. Ezequiel Petrillo, Mgr. David Žihala, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics