Morfologie jaderné laminy a funkce jaderných laminů při reparaci DNA

Bc. Barbora Malyšková

Master's thesis

Morphology of nuclear lamina and function of nuclear lamins during DNA repair

Abstract:

Tato diplomová práce je zaměřena na studium hladiny, uspořádání, počtu ohnisek a dynamiky jaderných proteinů HP1β (heterochromatin protein 1β), 53BP1 (p53-binding protein 1) a PCNA (proliferating cell nuclear antigen) podílejících se na opravě DNA v závislosti na přítomnosti funkčních složek jaderné laminy: laminů typu A a proteinu LAP2α (lamina-associated polypeptide 2α). Stanovení hladiny proteinů bylo provedeno metodou westernového přenosu a jaderné uspořádání proteinu 53BP1 bylo studováno pomocí imunofluorescence. K měření dynamiky fluorescenčně značených proteinů in vivo byla použita technika FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), která je založená na sledování rychlosti obnovy fluorescence ve fotovybělené oblasti buněčného jádra. Bylo zjištěno, že se dynamika 53BP1 a HP1β liší v závislosti na lokalizaci v ohniscích a mimo ně. Při studiu vlivu UV záření na dynamiku proteinu HP1β nebyly zaznamenány žádné rozdíly oproti kontrolním buňkám. Po poškození DNA způsobeném UV a γ-zářením nebyla pozorována změna hladiny proteinu HP1β u žádné z použitých buněčných linií. Po působení ionizujícího a UV záření došlo k nárůstu počtu ohnisek proteinu 53BP1, který byl u LMNA +/+ a LMNA -/- buněk srovnatelný. Počet ohnisek proteinu PCNA nebyl ovlivněn γ-zářením, ani nedostatkem funkčních laminů typu A. Další poznatky získané tímto způsobem nám mohou pomoci odhalit vliv jaderné laminy na funkci proteinů účastnících se oprav DNA a lépe pochopit mechanismy rozpoznání lézí v DNA.

Abstract:

This diploma thesis is focused on study of the level, arrangement, number of foci and dynamics of nuclear proteins HP1β (heterochromatin protein 1β), 53BP1 (p53-binding protein 1) and PCNA (proliferating cell nuclear antigen) involved in DNA repair in dependence on the presence of functional components of nuclear lamina: A-type lamins and LAP2α (lamina-associated polypeptide 2α). Detection of protein levels was performed by Western blotting and nuclear organization of protein 53BP1 was studied by immunofluorescence. To measure the dynamics of fluorescently labeled proteins in vivo we used FRAP technique, based on analysis of recovery of fluorescence in photobleached region inside the cell nucleus. It was found that the dynamics of mCherry-tagged 53BP1 and GFP-tagged HP1β was different depending on the localization in foci and away from them. When studying the effect of UV radiation on dynamics of GFP-HP1β we registered no differences in comparison with non-irradiated genome. After DNA damage induced by UV and γ-irradiation was observed no change in level of HP1β protein in any of used cell lines. After exposure to ionizing and ultraviolet radiation occured and increase in number of foci of protein 53BP1, which was same for the LMNA +/+ and LMNA -/- cells. The number of foci of protein PCNA was not influenced by γ-irradiation or by lack of A-type lamins. Together, our knowledge could help us to reveal the influence of the nuclear lamina on the function of DNA repair proteins to better understand the mechanisms of recognition of lesions after DNA injury.

Keywords

Chromatin, jaderná lamina, nuclear lamina, laminy typu A, A-type lamins, protein LAP2α, reparace DNA, DNA repair, konfokální mikroskopie, confocal microscopy, fluorescence, GFP, technika FRAP, FRAP technique, HP1, 53BP1, PCNA

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2016
• Supervisor: doc. RNDr. Eva Bártová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology