Stanovení glutathiondisulfidu v plné krvi pomocí HPLC s fluorescenční detekcí

Bc. Jarmila Čandová

Diplomová práce

Determination of whole blood glutathione disulfide using an HPLC with fluorescence detection

Anotace:

Porušení rovnováhy mezi prooxidačními a antioxidačními pochody v buňkách vede k oxidačnímu stresu. Významný podíl na udrţení této rovnováhy má glutathion. Tento nejhojněji zastoupený antioxidant se v buňkách vyskytuje převáţně v redukované formě. Působením oxidačních pochodů dochází k jeho přeměně na glutathiondisulfid. Důleţitým ukazatelem oxidačního stresu je poměr glutathiondisulfidu ke glutathionu. V této diplomové práci jsme se zaměřili na vypracování postupu pro stanovení glutathiondisulfidu v plné krvi a plazmě metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí. Při přípravě vzorku jsme dbali především na to, abychom v maximální moţné míře zabránili oxidaci glutathionu. Tento postup zahrnuje odběr krevních vzorků do zkumavek obsahujících citrát sodný a kyselinu citronovou (pH 4,2), přídavek alkylačního činidla (N-ethylmaleimidu) ihned po odběru a precipitaci proteinů 15% kyselinou trichloroctovou. Vzorky, které nelze zpracovat a analyzovat ihned, musí být ošetřeny N-ethylmaleimidem ještě před skladováním.

Abstract:

The imbalance between oxidizing and anti-oxidizing processes in cells leads to oxidative stress. Glutathione participates in maintaining of the balance. The most abundant antioxidant in cells occurs predominantly in reduced form. Action of oxidation processes leads to its conversion to glutathione disulfide. An important indicator of an oxidative stress is the ratio of glutathione disulfide to glutathione. In this thesis we focused on developing procedures for the determination of glutathione disulfide in whole blood and plasma by a high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. During the sample preparation, we tried to prevent glutathione oxidation. This procedure involved: a collection of blood samples into tubes containing sodium citrate and citric acid (pH 4.2), an addition of alkylation reagent (N-ethylmaleimide) immediately after collection, a protein precipitation by 15% trichloroacetic acid. Samples which cannot be processed and analyzed immediately, must be treated by N-ethylmaleimide before storage.

Klíčová slova

oxidační stres, glutathion, glutathiondisulfid, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, fluorescenční detekce, stanovení glutathiondisulfidu

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 31. 5. 2011
• Vedoucí: doc. Mgr. Roman Kanďár, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů