Chromatografické metody v analytice léků se zaměřením na fenotypizaci

Jiřina PROCHÁZKOVÁ

Bachelor's thesis

Chromatographic methods in drug analysis focus on phenotypization

Anotácia:

Cílem práce bylo zavést a validovat metodu pro fenotypizaci CYP2C9. Jako modelová látka pro fenotypizaci byl použit diklofenak. Ten byl stanovován spolu s jeho hlavním metabolitem 4OH-diklofenakem v krvi a v moči před a po podání dávky diklofenaku a následně byl vypočítán metabolický poměr. Protože asi 60 % podané dávky je vyloučeno močí jako glukuronid konjugáty, bylo nutné moč před stanovením hydrolyzovat. Byla provedena enzymatická hydrolýza s enzymy glukuronidázou a sulfatázou. Pro stanovení diklofenaku a 4-OH diklofenaku ve vzorcích byla použita HPLC metoda s mobilní fází o složení fosfátový pufr : acetonitril v poměru 60:40 a průtoku 0,1 ml/min. Použila se chromatografická kolona SGX o velikosti 1×150 mm, zrnění 5 ?m, detekce se prováděla při vlnové délce 280 nm. Jako vnitřní standard byl použit flunitrazepam. Metoda byla validována s těmito parametry: variační koeficient do 10 %, recovery 97-105 %, linearita 50-1000 ng/ml. Metoda byla otestována na pacientském vzorku séra a moči. Výsledky metabolického poměru v % (diklofenak/4OH-diklofenak) v séru byly: po 30 min po podání diklofenaku 54/46 a po 120 min 42/58. V moči bez hydrolýzy: mezi 0-4 hodinou po podání diklofenaku 72/28 a mezi 4-8 hodinou 76/24. V moči po hydrolýze: mezi 0-4 hodinou 50/50 a mezi 4-8 hodinou 24/76.

Abstract:

Method for phenotyping of CYP 2C9 was introduced and validated. Diclofenac was used, as a probe and was measured together with its main metabolite 4OH diclofenac in blood and urine before and after application. Metabolic ratio was calculated to correlate levels of parent drug and metabolite. While 60% of given dose of diclofenac is released as glucuronide conjugates, it was necessary to hydrolyse urine before estimation. Enzymatic hydrolysis with glucuronidase and small amount of sulphatase was made. Diclofenac and 4OH diclofenac were analysed with HPLC method using SGX column 1x150 mm, 5 um. Mobil phase was composed of phosphate buffer and acetonirile 60:40 with the rate 0,1 ml/min. Detection was performed at 280 nm and as internal standard. flunitrazepam was used Method was validated and parameters are as follows: coefficient of variations is below 10 %, recovery 97-105 %, linearity 50-1000 ng/ml. Finally, patient´ samples of serum and urine were tested. Results of metabolic ratios (diclofenac / 4-OH diclofenac) in serum were 30 min. after diclofenac administration 54/46 % and 2 hours after that 42/58 %, respectively. In urine without hydrolysis metabolic ratio was as follows: in the first portion of urine between 0-4 hours 72/28 % and in the second one between 4-8 hours 76/24 %. In hydrolysed urine metabolite ratios were changed and were 50/50 % and 24/76 % respectively.

Kľúčové slová

vysokoúčinná kapalinová chromatografie, diklofenak, fenotypizace

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 4. 2008

Identifikátor: 11339

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 2. 6. 2008
• Vedúci: RNDr. Hana Brozmanová, CSc.

University of Ostrava

Faculty of Medicine

Bachelor programme / odbor:
Specialization in Health Service / Health Laboratory Assistant