Využití metagenomických postupů pro detekci patogenů v klinické praxi

Bc. Annamária Macháčková

Master's thesis

The use of metagenomic approaches for the detection of pathogens in clinical practice

Abstract:

Detekce patogenů v rutinní diagnostice představuje komplexní proces, zahrnující metody kultivační či serologické, anebo metody molekulární (specifická PCR, univerzální PCR, Sangerovo sekvenování). Narůstající výskyt vzácných oportunních patogenů ztěžuje detekci již zavedenými postupy, které jsou přizpůsobené identifikaci typických patogenů. Běžně se používají metody specifické, kde je důležité tyto diagnostické metody přizpůsobit charakteristikám a vlastnostem daného patogenu. V dnešní době se v klinických laboratořích stále častěji používají nejnovější sekvenační technologie. Tyto nové metody molekulární biologie umožnují v krátkém čase získat obrovské množství sekvenačních dat, z nichž je možné identifikovat infekční agens nebo určit geny rezistence a virulence, v určitých případech i rychleji než standardními laboratorními metodami. Právě metagenomika je užitečný způsob detekce širokého spektra mikroorganismů se všemi jejich geny v jediné analýze. V klinické praxi je nutné optimalizovat a standardizovat protokol pro potřeby konkrétní laboratoře, na základě běžně vyšetřovaných vzorků a diagnostikovaných infekčních onemocnění. Metoda detekce by měla být cenově efektivní, relativně snadno proveditelná a dostatečně rychlá. V této práci se optimalizoval pracovní postup na sekvenátoru od společnosti Oxford Nanopore Technologies (ONT plc., UK) pro klinické účely. Naše výsledky se porovnávaly s výsledky rutinních metod, mezi které patří širokospektrá (nebo univerzální) PCR s následným sekvenováním dle Sangera a kultivační postupy mikrobiologické laboratoře. V experimentu byly zpracovány referenční kmeny i klinické vzorky chlopní získaných od pacientů s infekční endokarditidou. Pro detekci patogenů z těchto vzorků bylo použito jak cílené sekvenování genu pro 16S rRNA, tak metagenomické sekvenování. Tato práce prokázala, že metagenomika je v klinické laboratoři použitelná, avšak pouze za podmínky deplece lidské DNA.

Abstract:

Pathogen detection in routine diagnostics can be a complex process incorporating culture, serology or molecular methods (specific PCR, universal PCR, Sanger sequencing). Increasing incidence of rare opportunistic pathogens complicates detection with conventional laboratory techniques, which are adjusted for known and typical pathogen identification. It is common to use targeted methods, where it is especially important to adjust these diagnostic methods according to the pathogen´s characteristics and properties. Nowadays, it is more common to use the newest sequencing technologies in clinical laboratories. These new molecular-biology methods make it possible to obtain large amounts of sequence data in a short span of time, to be used for infectious agent identification and even resistance or virulence genes determination, in some cases even quicker than standard laboratory methods. Metagenomics is especially a very useful tool for the detection of a broad spectrum of microorganisms with their genes in a single run. In a clinical setting, it is essential to optimize and standardize the protocol for the specific laboratory needs, based on the sample used and infectious disease being diagnosed. The method of detection needs to be cost effective, easy to use and sufficiently quick. In this thesis, the workflow for the sequencer by company Oxford Nanopore Technologies (ONT plc., UK) was being optimized for clinical use. Our results were compared to routine diagnostic methods, which include broad-range PCR followed by Sanger sequencing and the cultivation approach of microbial laboratory. Microbial strains from collection and clinical samples of heart valves obtained from patients with infectious endocarditis were processed in this experiment. For pathogen detection from these samples, both targeted 16S rRNA sequencing and metagenomic sequencing were used. This work proved that metagenomics is applicable to the clinical setting, but only under the condition of human DNA depletion.

Keywords

sekvenování nové generace, Oxford Nanopore Technologies, MinION, Flongle, metagenomika, klinická praxe, infekční endokarditida, new generation sequencing, metagenomics, clinical setting, infective endocarditis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2023
• Supervisor: prof. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.
• Reader: Mgr. Lenka Kosečková Micenková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Microbiology / Microbiology