Změny v transdukci signálu zprostředkované receptorem gp130 u embryonálních kmenových buněk za modifikovaných oxidačně-redukčních podmínek

Bc. Jan Kučera, Ph.D.

Master's thesis

A changes of gp130 receptor signalling under various redox-oxidation condition in embryonic stem cellsA changes of gp130 receptor signalling under various redox-oxidation condition in embryonic stem cellsA changes of gp130 receptor signalling under various redox-oxidation condition in embryonic stem cells

Abstract:

Gp130 je ústřední součástí transmembránového receptorového komplexu, který je využíván řadou cytokinů, jejichž pleiotropní účinky významně ovlivňují fyziologii celého organismu. Signalizace gp130 je také zahrnuta v mnoha patologických stavech včetně nádorových onemocnění. Klíčovou roli hraje v udržování nediferencovaného stavu kmenových buněk. Ty jsou v průběhu embryogeneze nebo okupováním specifických mikroprostředí označovaných jako „niche“ vystaveny sníženému množství O2. Hypoxie přispívá ke zvýšené tvorbě reaktivních metabolitů kyslíku. Ty jsou považovány za významné signální molekuly. Podílejí se na intracelulární redukčně oxidační (redoxní) rovnováze. Ta je dána množstvím a aktivitou redukčních a oxidačních látek v buňce a představuje významný faktor ovlivňující buněčné pochody. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, jakým způsobem se narušení intracelulární redoxní rovnováhy odráží na signalizaci gp130, s důrazem na regulaci specifických vlastností kmenových buněk. Jako model byly zvoleny myší embryonální kmenové buňky a jim podobné embryonální karcinomové buňky. K narušení redoxní rovnováhy byl použit apocynin (inhibitor NADPH oxidázy a možný vychytávací antioxidant), difenyleneiodonium (flavoproteinový inhibitor) a N-acetyl cystein (vychytávací antioxidant, prekurzor glutathionu). K vyhodnocení vlivu těchto látek na buňky bylo využito mnoho metod. Mezi jinými Western blot, průtoková cytometrie, luciferázový reportérový test a stanovení koncentrace proteinu. Přídavek redoxních činidel měl za následek omezení růstu buněk, změny v rozložení fází buněčného cyklu a významně ovlivněna byla i fosforylace a aktivace komponent signální dráhy gp130. Na základě dosažených výsledků je možné tvrdit, že dráha gp130 je citlivá k narušení intracelulární redoxní rovnováhy.

Abstract:

The gp130 system is a set of ligands and receptors that elicits multiple biological responses by the formation of oligomeric signalling complexes that contain one or more copies of a common transmembrane transducing receptor gp130. Gp130 signalling is implicated in a large nubmer of diseases including neoplastic disorders and is also crucial for maintaining undifferentiated state of stem cells. During embryonic development or by occupying specialized microenvironment called niche, stem cells are exposed to lower O2 concentrations. Hypoxia increases reactive oxygen species (ROS) generation. ROS have been considered important intracellular signaling molecules, which may act as mediators or second messengers. They also affect intracelullar redox balance (the ratio between oxidizing and reducing species within the cell) that plays significant role in the regulation of celullar processes. The aim of this diploma thesis was to investigate overall impact of induced intracellular redox imbalance on gp130 signalling with emphasis on the stem cell regulation. We used mouse embryonic stem cells and mouse embryonic carcinoma cells as the model. To modify their intracelullar redox balance we used apocynin (NADPH oxidase inhibitor and possible ROS scavenger), diphenyleneiodonium (flavoprotein inhibitor) and N-acetylcysteine (ROS scavenger, glutathione precursor). Treated cells were analysed using numerous methods including Western blot, flow cytometry, luciferase reporter assay and protein assay. Redox imbalance resulted in decreased rate of proliferation, different cell cycle distribution and altered fosforylation and activation of gp130 signalling pathways. Therefore we speculate, that gp130 system is redox-sensitive.

Keywords

gp130, signální dráha, embryonální kmenové buňky, reaktivní metabolity kyslíku, ROS, antioxidant, redukčně oxidační prostředí, redox gp130, signalling, embryonic stem cells, ES, Reactive oxygen species, redox

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 11. 6. 2009
• Supervisor: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology