Regulation of inflammatory responce by hyaluronan of different molecular weight

Mgr. Barbora Šafránková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

V posledních dvou dekádách se změnil náš pohled na mnoho lidských nemocí. Nové objevy pomohly odhalit propojení mezi mírným chronickým zánětem a nemocemi jako je astma, závětlivá střevní onemocnění, artritida, kardiovaskulární onemocnění, obezita, diabetes, rakovina nebo autoimunitní nemoci. Pochopení změn a úloh jednotlivých složek mezibuněčné hmoty (ECM) v průběhu chronického zánětu přispívá k možnému nalezení nových terapeutických přístupů. Hyaluronan, také známý jako kyselina hyaluronová (HA), představuje jednu z důležitých součástí ECM. HA nabízí širokou škálu působení, které, jak se zdá, se odvíjí od velikosti molekuly. Nativní, vysokomolekulární (HMW) HA s MW kolem 800 kDa a vyšší, slouží jako součást tkání zajišťující hydrataci, uspořádanost, viskoelasticitu a přispívá k obnově tkání. Naproti tomu je fragmentovaný HA hromaděn během zánětu a poškození tkáně. Nativní HA může být degradován na menší fragmenty pomocí reaktivních kyslíkových metabolitů (ROS) a díky specifickým enzymům zvaným hyaluronidázy v místě poškození. V takových případech fragmenty HA, mající obvykle pod 500 kDa, ovlivňují produkci cytokinů a dalších prozánětlivých mediátorů a aktivaci s následnou migraci a chemotaxi prozánětlivých buněk. Působení HA závisí také na inkerakcích s jeho vazebnými proteiny a typu buněk. Vazba HA na široké spektrum proteinů vede k jeho biologickému působení. Interakce HA s CD44 je již dlouho dobu považována za důležitou pro aktivaci a migraci leukocytů. Novější poznatky o vazbě HA na Toll-like receptory (TLRs) poskytují informace o mechanizmu, kterým na molekární úrovni HA zprostředkovaná signalizaci v rámci prozánětlivých buněk stejně jako s buňkami epiteliálními. Poměrně nová hypotéza přichází s návrhem, že HA může působit jako jedna z endogenních molekul upozorňujících na poškození. HA a jeho vazebné proteiny hrají více či méně důležitou roli v patogenezi mnoha lidských onemocnění a za četných experimentálních podmínek. Pochopení úlohy HA a jeho vazebných proteinů v rámci patobiologie onemocnění může usnadnit vývoj nových léků pro mnoho závažných nemocí. Hlavním cílem v rámci této práce bylo otestovat schopnost různých, přesně definovaných MW HA aktivovat odlišné buňky podílející se následné zánětlivé odpovědi. Stimulační a prozánětlivé působení je spojováno převážně s HA o nízké molekulové hmotnosti (LMW), zatímco HMW HA je popisován především jako protizánětlivě působící látka. Na začátku byl pozorován vliv HA o různé MW (11, 52, 87, 250 and 970 kDa) na linie myších makrofágů RAW 264.7 a MH-S. Přestože byl aktivační vliv LMW HA a prozánětlivý stav tlumící vliv HMW HA na preaktivované makrofágy v literatuře již popsán, námi testovaný HA nevykazoval významný aktivační potenciál ve sledovaných parametrech spojených s aktivací makrofágů a to ani jako samotný HA ani v kombinaci s lipopolysacharidem (LPS), stejně jako se po ovlivnění HMW HA nepotvrdilo jeho tlumící působení na buňky preaktivované pomocí LPS. Dalším vybraným modelem byla lidská krev a to pro větší komplexnost systému. Je zajímavé, že tentokrát všechny MW HA (72, 250 and 970 kDa) aktivovaly fagocyty v krvi, což bylo pozorováno pomocí spontánní produkce ROS, degranulace a produkce tumor nekrotizujícího faktoru α (TNFα). Nejvyšší schopnost aktivovat buňky byla pozorována při ovlivnění HA o nejnižší MW, zatímco HMW 970 kDa HA vykazoval nejnižší aktivační schopnost. Tyto výsledky jsou částečně v rozporu s obecně přijímaným pohledem na působení HA. Jedno z možných vysvětlení tohoto rozporu spočívá v čistotě HA. Proto byla poslední práce zaměřena na srovnání působení různ

Abstract:

ých MW HA získaných ze dvou zdrojů. Bylo provedeno srovnání schopnosti aktivovat vybrané myší imunitní buňky pomocí HA připraveného z kohoutích hřebínků (100, 500 a 997 kDa) a biotechnologicky připraveného HA s využitím bakterie Streptococcus equi (71, 500 a 1000 kDa). Pouze HMW HA a HA o střední MW z obou zdrojů vyvolal u RAW 264.7 a makrofágů izolovaných z kostní dřeně (BMDM) zvýšenou produkci TNFα, ale tento vliv byl obecně významnější u HA živočišného původu. Podobné trendy byly pozorovány s užitím izolovaných myších splenocytů a plné myší krve. Všechen testovaný HA také vyvolal u splenocytů produkci ROS, nicméně tento efekt nebyl závislý na MW či zdroji HA. Žádný testovaný HA neindukoval expresi cyklooxygenázy 2 (COX-2) či inducibilní syntázy oxidu dusnatého (iNOS) na proteinové úrovni a žádný neindukoval produkci NO v myší makrofágové linii RAW 264.7 a primárních BMDM. Výsledky ani nepotvrzují ani nevyvracejí obecně přijímané tvrzení, že působení HA závisí na jeho MW. Faktory jako jsou čistota HA, stav buněk, tkání a organizmu také hrají důležitou roli v našem pochopení toho, jak HA působí.

Abstract:

In a last two decades our view of many human diseases has been changed. New findings show a connection between low grade chronic inflammation and diseases such as asthma, inflammatory bowel diseases, arthtitis, cardiovascular diseases, obesity, diabetes, cancer or autoimmune diseases. The understanding of changes and roles of particular extracellular matrix (ECM) components under chronic inflammation contributes to the potential findings of new therapeutic approach. Hyaluronan, also named hyaluronic acid (HA), is one of the important parts of the ECM. HA shows astonishing arrays of actions which seem to depend on its molecular size. Native, high molecular weight (HMW) HA with MW over 800 kDa and more, serves as tissue component which maintains hydration, organization, viscoelasticity and contributes to tissues repair. On the other hand, fragmented HA is accumulated during inflammation and tissue injury. Native HA can be degraded to smaller fragments by reactive oxygen species (ROS) and by specific enzymes named hyaluronidases at the injury site. In such cases HA fragments, usually below 500 kDa, regulates production of cytokines and other inflammatory mediators and influence inflammatory cell recruitment and chemotaxis. The actions of HA are also dependent on its interacting proteins and cell types. HA binds to an array of proteins to evoke its biological roles. Interactions HA with CD44 have long been suggested to be important in leukocyte homing and recruitment. The recent knowledge about HA interactions with Toll-like receptors (TLRs) provides molecular insight into the mechanisms of HA signaling in inflammatory cells as well as in epithelial cells. Relatively new hypothesis suggest HA fragments can act as one of the endogenous signals of damage. HA and its binding proteins play more or less important role in the pathogenesis of many human diseases and in numerous experimental conditions. Our understanding the role of HA and its binding proteins in the pathobiology of disease will facilitate the development of novel therapeutics for many critical diseases. The main aim of this thesis was to test an ability of different, precisely defined MW HA to activate various cells involved in the subsequent inflammatory response. Stimulatory and pro-inflammatory effect is attached predominantly for the low molecular weight (LMW) HA, whereas HMW HA is described mainly as anti-inflammatory substance. Firstly the effect of different molecular weight HA (11, 52, 87, 250 and 970 kDa) was observed using mouse macrophage lines RAW 264.7 and MH-S. Although the activation effect of LMW HA and the inflammation suppressive effect of HMW HA on pre-activated macrophages was described in literature previously, tested HA showed no significant activation in the monitored parameters on macrophages, either alone or in combination with lipopolysaccharide (LPS), as well as no the suppressive effect after HMW HA treatment of LPS pre-activated cells. The next selected model was human blood for its comprehensiveness. Interestingly, all used HA (72, 250 and 970 kDa) activated blood phagocytes including the spontaneous production of ROS, degranulation, and the production of tumor necrosis factor α (TNFα). The highest ability to activate the cells was observed for the lowest used HA whereas HMW 970 kDa HA showed the lowest potency. The results are partially in conflict with generally accepted view of the HA effect. One of the possible explanations for this discrepancy is the purity of HA. Therefore the last work was focused on the the comparision of the effect of different MW HA from two sources. The comparison of ability to activate selected mouse immune cells by HA preparation from rooster comb (100, 500 and 997 kDa) and Streptococcus equi biotechnological origin (71, 500 and 1000 kDa) was done. Only HMW and middle size MW HA preparations of both origin induced TNF-α release from RAW 264.7 and mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM), but this effect w

Abstract:

as generally more significant for HA of animal origin. Similar trends were observed employing isolated mouse splenocytes and mouse whole blood. All tested HA preparations also induced ROS production by isolated splenocytes; however, this effect was independent of the MW and origin of HA. All HA preparations failed to induce protein expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) and production of NO in mouse macrophages cell line RAW 264.7 and primary BMDM.These results neither confirm nor disprove the established dogma that the effect of HA depends on its MW. The factors as HA purity, condition of the cells, tissue and body also play important role in our understanding of HA working.

Keywords

hyaluronan, sterilní zánět, makrofágy, neutrofilní granulocyty, CD44, molekulární vzory spojené s poškozením, sterile inflammation, macrophages, neutrophil granulocytes, damage associated molecular patterns

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 8. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 18. 9. 2014
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: MVDr. Martin Faldyna, Ph.D., doc. RNDr. Antonín Lojek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology